結(jié)核分枝桿菌菌懸液光密度值與菌落計(jì)數(shù)的關(guān)聯(lián)性

秦云賀，王藝紅，郭慶龍，王洪海，張雪蓮

(復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上?！?00438)

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·論著·

結(jié)核分枝桿菌菌懸液光密度值與菌落計(jì)數(shù)的關(guān)聯(lián)性

秦云賀，王藝紅，郭慶龍，王洪海，張雪蓮

(復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200438)

[摘要]目的建立一種基于光密度值計(jì)算結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)的可靠方法。方法利用低頻超聲和玻璃珠研磨兩種方法制備H37Ra菌懸液，菌懸液2倍梯度稀釋后，分別測(cè)定各個(gè)稀釋度菌懸液在600 nm處的光密度值(OD600值)，并分析OD600值與稀釋倍數(shù)曲線，確定最佳的菌懸液制備方法，OD600線性范圍，以及OD600值與CFU關(guān)聯(lián)曲線。結(jié)果OD600值為0.1～0.6，線性范圍內(nèi)OD600值與稀釋倍數(shù)線性回歸分析結(jié)果顯示，玻璃珠研磨法和低頻超聲法相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.98、1.00，均呈良好的相關(guān)性，且低頻超聲法比玻璃珠研磨法的相關(guān)性好，其菌液分散更均勻。OD600值與CFU值線性回歸分析結(jié)果顯示，玻璃珠研磨法和低頻超聲法回歸方程分別是：CFU=2.35×107×OD600+4.42×105、CFU=3.26×107×OD600+6.89×105。結(jié)論低頻超聲法是一種較好的結(jié)核分枝桿菌菌懸液制備方法，結(jié)合OD600值測(cè)定，可成為一種可靠、快速的結(jié)核分枝桿菌定量方法。

[關(guān)鍵詞]結(jié)核分枝桿菌； 菌落形成單位； OD600； CFU； 定量； 低頻超聲法； 玻璃珠研磨法

[Chin J Infect Control，2016，15(3)：150-154]

結(jié)核病(tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tb)引起的傳染性疾病，該病已成為危害人類(lèi)健康的“頭號(hào)殺手”[1]。近年來(lái)，隨著卡介苗(BCG)免疫保護(hù)力下降[2]、人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)全球流行[3]，以及耐藥結(jié)核病[4](drug-resistant tuberculosis,DR-TB)的出現(xiàn)，使得發(fā)現(xiàn)新型免疫保護(hù)性抗原、新型抗結(jié)核藥物，以及細(xì)菌與宿主細(xì)胞相互作用等結(jié)核分枝桿菌基礎(chǔ)性研究和相關(guān)應(yīng)用愈加重要，其中藥物敏感試驗(yàn)、細(xì)胞侵染試驗(yàn)[5]及動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)[6]等均需準(zhǔn)確測(cè)定結(jié)核分枝桿菌的菌量。目前，結(jié)核分枝桿菌定量方法主要包括CFU計(jì)數(shù)法、麥?zhǔn)媳葷岱肮饷芏确╗7-8]，CFU計(jì)數(shù)方法相對(duì)準(zhǔn)確性高，但周期長(zhǎng)，不適用于實(shí)際研究中菌液濃度的快速測(cè)定；麥?zhǔn)媳葷岱ㄊ墙?jīng)典的應(yīng)用于普通微生物濃度測(cè)定的方法，該方法用于結(jié)核分枝桿菌定量可操作性和重復(fù)性差；基于光密度值的定量方法具有簡(jiǎn)單、便捷、快速的優(yōu)勢(shì)，是一種相對(duì)實(shí)用的定量方法。但由于結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)呈顆粒狀，菌懸液制備方法以及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)儀器、細(xì)菌培養(yǎng)方法等方面的差異，導(dǎo)致該方法缺乏統(tǒng)一的定量標(biāo)準(zhǔn)，需要探索一種簡(jiǎn)便可靠的方法，便于結(jié)核分枝桿菌定量。本研究對(duì)比分析低頻超聲法及玻璃珠研磨法兩種菌懸液制備方法，對(duì)菌懸液制備方法、菌懸液600 nm處的光密度值(OD600值)與稀釋倍數(shù)關(guān)系、OD600值與CFU關(guān)系等進(jìn)行分析和探討。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株結(jié)核分枝桿菌菌株H37Ra為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2儀器和試劑酶標(biāo)儀(BioTek)、水浴超聲儀(Bioruptor Next Gen UCD-300)、渦旋振蕩器(SCILOGEX MX-S)、尼康正置熒光顯微鏡(Nikon)、4.0 mm玻璃珠(復(fù)旦大學(xué)材料供應(yīng)中心)、96孔板(上海睿安生物科技有限公司)、Middlebrook 7H9和7H10(Difco)、Tween80和甘油(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、ADC(0.5%牛血清白蛋白、0.2%葡萄糖、0.85%氯化鈉)，所用化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1結(jié)核分枝桿菌H37Ra的培養(yǎng)用接種環(huán)于7H10-10%ADC固體板劃線接種H37Ra，37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2～3周，備用。

1.2.2菌懸液制備

1.2.2.1玻璃珠研磨法接種環(huán)刮取3環(huán)于7H10-ADC固體板上生長(zhǎng)2～3周的菌體，轉(zhuǎn)移至含800 μL 液體培養(yǎng)基(7H9、0.05%Tween80、0.5%甘油、10%ADC)的2.0 mL EP管中，加入5粒4.0 mm 磁珠，置于渦旋振蕩器上，工作速率調(diào)至第三檔，渦旋5 min左右。震蕩過(guò)程中，觀察EP管中液體是否充分震懸并隨時(shí)調(diào)整振蕩角度，肉眼觀察無(wú)可見(jiàn)菌塊且懸液分散均勻停止振蕩，轉(zhuǎn)移至含5.2 mL液體培養(yǎng)基中，靜置30 min，取上層菌液，在顯微鏡下觀察玻璃珠處理后菌體分散狀況。

1.2.2.2低頻超聲法接種環(huán)刮取3環(huán)于Middlebrook 7H10固體板(Middlebrook 7H10、0.5%甘油、10%ADC)上生長(zhǎng)2～3周的菌體，轉(zhuǎn)移至含6.0 mL液體培養(yǎng)基中，將菌液分裝在無(wú)菌2.0 mL EP管中，500 μL/管，水浴超聲儀功率調(diào)至“LOW”狀態(tài)，工作15 s，停15 s，共8個(gè)循環(huán)，勿過(guò)度延長(zhǎng)超聲時(shí)間，200 g 10 min低速離心，取上層菌懸液，在顯微鏡下觀察菌液超聲處理前后分散情況。

1.2.3CFU計(jì)數(shù)將制備的菌懸液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e取梯度稀釋的菌懸液200 μL涂布Middlebrook 7H10固體板，37 ℃靜置培養(yǎng)3～4周，分別計(jì)算CFU，每個(gè)稀釋度的菌懸液接種3個(gè)平板。

1.2.4菌懸液光密度值測(cè)定

1.2.4.1菌懸液可見(jiàn)光區(qū)波長(zhǎng)掃描以液體培養(yǎng)基為本底，含適量濃度H37Ra的菌懸液為樣品，利用酶標(biāo)儀掃描其(400～800)nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收曲線，間隔為1 nm，并校正光程，通過(guò)菌液吸收曲線確定600 nm是否為其較好的吸光度測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.4.2酶標(biāo)儀測(cè)定菌懸液光密度值分別將兩種方法制備的菌懸液進(jìn)行2倍梯度稀釋?zhuān)B續(xù)稀釋4個(gè)梯度(2、4、8、16倍)并利用酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)稀釋梯度λ=600 nm處的光密度值，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每種菌懸液均重復(fù)兩次。

1.3數(shù)據(jù)處理所得光密度值均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，利用Origin 8.0數(shù)據(jù)處理軟件分析OD600與稀釋倍數(shù)關(guān)系，并確定OD600線性范圍；根據(jù)CFU計(jì)數(shù)結(jié)果，進(jìn)行CFU與OD600回歸分析。

2結(jié)果

2.1菌懸液制備結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)易積聚，常規(guī)方法不易將其均勻分散，本實(shí)驗(yàn)采用兩種細(xì)菌分散方法對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Ra株進(jìn)行處理，結(jié)果顯示玻璃珠研磨結(jié)核分枝桿菌5 min可增加細(xì)菌的分散度，但分散細(xì)菌團(tuán)塊沉降率較大，需靜置30 min；低頻水浴超聲處理結(jié)核分枝桿菌后明顯增加菌液的分散度，且低頻超聲法細(xì)菌懸液較為均勻。見(jiàn)圖1。

A:未處理；B:玻璃珠研磨法處理后；C:低頻超聲法處理后

2.2CFU計(jì)數(shù)將兩種方法制備并稀釋的結(jié)核分枝桿菌菌懸液分別涂布Middlebrook7H10固體培養(yǎng)板，37 ℃培養(yǎng)3～4周后計(jì)菌落數(shù)，低頻超聲分散法菌落數(shù)比玻璃珠研磨法菌落數(shù)多，但兩種方法制備的菌懸液在同一稀釋倍數(shù)下細(xì)菌數(shù)無(wú)數(shù)量級(jí)差異。

2.3菌懸液可見(jiàn)光區(qū)波長(zhǎng)掃描圖根據(jù)測(cè)定波長(zhǎng)選擇原則：選擇斜率較小處的波長(zhǎng)，以保證其穩(wěn)定性；具有適當(dāng)?shù)奈罩?，確保其靈敏度，菌懸液在可見(jiàn)光區(qū)400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，無(wú)最大吸收，菌懸液測(cè)定中500～650 nm內(nèi)測(cè)定波長(zhǎng)均符合要求，本研究采用600 nm測(cè)定波長(zhǎng)。見(jiàn)圖2。

圖2 　可見(jiàn)光區(qū)結(jié)核分枝桿菌H37Ra的光密度值

2.4OD600值酶標(biāo)儀測(cè)定兩種不同稀釋梯度的菌懸液OD600值，結(jié)果顯示兩種方法制備的菌懸液吸光值均具有明顯的梯度依賴(lài)性，其線性相關(guān)區(qū)間OD600值為0.1～0.6。見(jiàn)表1。線性范圍內(nèi)OD600值與稀釋倍數(shù)線性回歸分析，結(jié)果顯示玻璃珠研磨法和低頻超聲法相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.98、1.00，均呈良好的相關(guān)性。見(jiàn)圖3。低頻超聲法制備的菌懸液多次測(cè)定結(jié)果重復(fù)性及穩(wěn)定性好于玻璃珠研磨法。

表1兩種不同稀釋梯度結(jié)核分枝桿菌菌懸液OD600值

Table 1OD600 ofM.tbsuspension at two different dilution ratios

稀釋倍數(shù)玻璃珠研磨法低頻超聲法11.89±0.151.90±0.0920.68±0.070.76±0.0240.37±0.060.37±0.0380.14±0.030.17±0.01160.08±0.010.08±0.01

2.5OD600值與CFU值回歸分析對(duì)OD600值與CFU值進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果顯示玻璃珠研磨法和低頻超聲法回歸方程分別是：CFU=2.35×107×OD600+4.42×105、CFU=3.26×107×OD600+6.89×105。

A：玻璃珠研磨法(R2=0.98)；B：低頻超聲法(R2=1.00)

3討論

結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁脂質(zhì)含量較高，在液體或固體培養(yǎng)基培養(yǎng)下，細(xì)菌均呈顆粒狀，因此在進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌基礎(chǔ)研究和臨床藥物敏感性測(cè)定中，細(xì)菌準(zhǔn)確定量是一個(gè)影響結(jié)果穩(wěn)定性的重要因素。CFU計(jì)數(shù)、麥?zhǔn)媳葷岱?、稱(chēng)重法等傳統(tǒng)結(jié)核桿菌定量方法時(shí)間周期長(zhǎng)，可操作性及重復(fù)性差。分光光度計(jì)的操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度和重復(fù)性好，因此紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定細(xì)菌懸液的光密度值成為一種細(xì)菌定量的快速、實(shí)用的方法，然而結(jié)核桿菌呈顆粒狀生長(zhǎng)的特點(diǎn)使得光密度細(xì)菌定量法的穩(wěn)定性受到很大影響，制定一套標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)核桿菌OD600值與CFU關(guān)聯(lián)方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值。Peuelas-Urquides等[9]曾對(duì)光密度法進(jìn)行了初步探索，對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv(ATCC27294)CFU值和菌懸液OD600值關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示OD600值為0.39時(shí)，其CFU數(shù)值為1.97×106/mL。本研究立足于實(shí)驗(yàn)室條件，對(duì)比分析玻璃珠研磨法和低頻超聲法兩種方法，計(jì)算OD600值與細(xì)菌CFU計(jì)數(shù)之間的函數(shù)關(guān)系，確定了不同制備方法獲得的菌懸液光密度值與細(xì)菌數(shù)量對(duì)應(yīng)關(guān)系。

本研究中采用了低頻超聲法分散細(xì)菌，CFU計(jì)數(shù)結(jié)果表明低頻率超聲不會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌破裂，對(duì)結(jié)核分枝桿菌活力沒(méi)有影響，其結(jié)果高于玻璃珠研磨法所獲得菌懸液CFU數(shù)量。與傳統(tǒng)的玻璃珠研磨法相比，低頻超聲法制備的菌懸液分散度高、菌體多單個(gè)存在。實(shí)驗(yàn)中玻璃珠研磨菌體5 min后采用30 min靜置而非離心方法，主要由于玻璃珠研磨后，細(xì)菌的顆粒依然比較大，低速離心會(huì)嚴(yán)重降低菌懸液中細(xì)菌數(shù)量。另外，在OD600值測(cè)定中，低頻超聲法具有較高重復(fù)性，而玻璃珠研磨法所獲得菌懸液沉降較快，同一樣品的不同時(shí)間測(cè)定結(jié)果偏差很大。

本實(shí)驗(yàn)表明，兩種方法均可用于結(jié)核分枝桿菌的菌懸液制備，低頻超聲法比玻璃珠研磨法重復(fù)性好、菌體分散良好，在進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌基因敲除株、重組株構(gòu)建等試驗(yàn)制備感受態(tài)細(xì)菌時(shí)，可采用低頻超聲法獲得較為均一的菌懸液，有利于電轉(zhuǎn)外源DNA和后期陽(yáng)性細(xì)菌克隆的篩選；對(duì)細(xì)菌數(shù)量要求較為精確的實(shí)驗(yàn)，如藥敏試驗(yàn)也可采用低頻超聲法制備菌懸液。值得注意的是，在使用玻璃珠分散結(jié)核分枝桿菌時(shí)，要避免因菌懸液沉降較快，而導(dǎo)致同一樣品不同時(shí)間測(cè)定結(jié)果之間的偏差。同時(shí)由于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用的振蕩器或水浴超聲儀的型號(hào)不同，在制備菌懸液時(shí)，需要根據(jù)儀器震蕩或超聲頻率的不同，調(diào)整制備菌懸液的具體操作時(shí)間和頻率。

結(jié)核分枝桿菌的準(zhǔn)確定量具有重要的研究意義，本研究中所采用的OD600值與CFU關(guān)聯(lián)方法具有普遍適用性，低頻超聲法可操作性和重復(fù)性好，可以為各個(gè)實(shí)驗(yàn)室建立基于OD600值的結(jié)核分枝桿菌定量標(biāo)準(zhǔn)提供重要的參考。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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(本文編輯：豆清婭)

Correlation between optical density and colony forming units ofMycobacteriumtuberculosissuspension

QINYun-he,WANGYi-hong,GUOQing-long,WANGHong-hai,ZHANGXue-lian

(SchoolofLifeScience,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish a reliable approach for quantification of colony forming unit(CFU) of Mycobacterium tuberculosis(M.tb) by measuring optical density(OD).MethodsM.tb suspension H37Ra was prepared using low-power ultrasonic or glass bead beating methods, and was two-fold serially diluted, OD at 600nm (OD600) of each dilution ratio was measured respectively, OD600 and dilution curve were analyzed to determine the optimum approach for preparing bacterial suspension，linear range of OD600, as well as linear relationship between OD600 and CFU.ResultsOD600 was 0.1-0.6, linear regression analysis of OD600 and dilution ratio within linear range revealed that correlation coefficient (R2) of glass bead beating and low-power ultrasonic methods were 0.98 and 1.00 respectively，both presented a good correlation, low-power ultrasonic method was better than glass bead beating method, bacterial suspension dispersed more evenly. Linear regression analysis results of OD600 and CFU values showed that the regression equation of glass bead beating method and low-power ultrasonic method were CFU=2.35×107×OD600+4.42×105 and CFU=3.26×107×OD600+6.89×105 respectively.ConclusionLow-power ultrasonic method is a good method for preparation of M.tb suspension，combined the measurement of OD600 value， it can be a reliable and rapid method for quantitative analysis of M.tb.

[Key words]Mycobacterium tuberculosis; colony forming unit； OD600； CFU； quantification; low-power ultrasonic method; glass bead beating method

[中圖分類(lèi)號(hào)]R378.91+1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-9638(2016)03-0150-05

DOI:10.3969/j.issn.1671-9638.2016.03.002

[作者簡(jiǎn)介]秦云賀(1988-)，男(漢族)，河南省新鄉(xiāng)市人，碩士，主要從事新型抗結(jié)核藥物發(fā)現(xiàn)和機(jī)制研究。[通信作者]張雪蓮E-mail：xuelianzhang@fudan.edu.cn

[基金項(xiàng)目]上海市科技支撐項(xiàng)目(15431900200)

[收稿日期]2015-07-25