探析三七中三七素及其異構體的高效液相色譜檢測

馮偉旭

哈藥集團世一堂制藥廠 150000

探析三七中三七素及其異構體的高效液相色譜檢測

馮偉旭

哈藥集團世一堂制藥廠 150000

目的：采用 2，4-二硝基氟苯為柱前衍生試劑，建立測定三七中三七素(β-ODAP)及其異構體(α-ODAP)的柱前衍生反相高效液相色譜法。方法：采用Luna-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相為乙腈∶HAc-NaAc(17∶83)；檢測波長360nm；柱溫40℃；進樣量 20μL。結果：三七素(β-ODAP)色譜峰的峰面積與其濃度在 0.30～50.50μg/mL范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為A1=140.50C1+72.30，r1=0.9995；三七素構體(α-ODAP)色譜峰的峰面積與其濃度在0.10～16.15μg/mL范圍內呈現良好的線性關系，回歸方程為 A2=106.60C2+56.00，r2=0.9992。結論：不同三七樣品中均存在檢出的三七素(β-ODAP)及其異構體(α-ODAP)。該方法操作簡便、快速、準確，選擇性好，可用于植物、藥物及食品中三七素及其異構體含量的測定。

三七素；2，4-二硝基氟苯；柱前衍生；HPLC

在對我國中藥三七進行深入研究中，發現其自身具備止血治療效果的主要成分在于三七素，這種成分的在化學上是一種非蛋白游離氨基酸。也就是說三七素這種氨基酸并不能組成人體需要的蛋白質。盡管這種物質叫做你三七素，但是并不代表這種物質只存在于三七這種中草藥中，在醫學實踐研究中，發現人參、豬屎豆和蘇鐵等草藥中也含有三七素的成分。另外在對三七素進行深入研究中，發現其在對患者進行止血治療的過程中還存在一定毒副作用。以下就針對于三七素自身毒副作用和臨床藥效進行深入研究。

一、儀器與材料

（一）儀器

高效液相色譜儀(Agilent1100)；Luna-C18色譜柱(250mm× 4.6mm，5μm)。

（二）材料

ODAP對照品(蘭州大學生物實驗室分離提純，于NaHCO3溶液中保存)；2，4二硝基氟苯(分析純，某市生工生物，乙腈配成10.0mg/mL的溶液)；磷酸鹽緩沖溶液(pH6.9)；HAc-NaAc緩沖溶液(pH4.5)；乙腈(色譜純，某市科密歐化學試劑有限公司)。實驗用三七幼苗為采自云南文山生長 15d的三七幼苗(本實驗室蛭石萌發后用文山當地土壤移栽)，實驗用三七塊根、須根購自云南文山，經天水師范學院王廷璞教授鑒定為五加科植物三七的幼苗、塊根與須根。

二、方法與結果

（一）色譜條件

色譜柱：Luna-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈∶HAc-NaAc緩沖溶液(17∶83)；柱溫：40℃；檢測波長：360nm；流速：1.0mL/min；進樣量：20μL。

（二）三七素的衍生化反應

準確吸取一定量ODAP對照品儲備液(NaHCO3溶液配置)，加入一定體積的FDNB溶液(15倍質量比于三七素)，于60℃恒溫水浴鍋中衍生反應30min，取出，冷卻至室溫，用移液器準確移取一定體積的對照品衍生溶液，以磷酸鹽緩沖溶液定容至1mL，配制0.40～1.2×103μg/mL9個系列對照品溶液，用0.45μm微孔濾膜過濾后待用。

（三）三七樣品溶液的制備

準確稱取三七幼苗的不同新鮮組織(葉、莖、根)、干燥塊根粉和須根粉各1g(每個樣品平行3份)，置于-20℃冰箱冷凍保存，用事先在-20℃冰箱中冷凍過的研缽進行研磨。準確加入30%乙醇7mL作為抽提液，研至勻漿后，靜置3min，取上清液1.50mL置離心管中于-4℃下冷凍離心15min(15000r/min)，精密移取1mL上清液置于離心管中，于60℃恒溫真空干燥，待樣品完全烘干后，向樣品中加入100μLNaHCO3溶液，充分震蕩，使其溶解，再加入100μLFDNB溶液，于60℃恒溫水浴鍋中進行衍生反應，30min后取出，冷卻至室溫，加入 800μL磷酸鹽緩沖溶液，以0.5mol/LNaHCO3溶液定容至1mL，用0.45μm微孔濾膜過濾，取濾液進行測定。

（四）線性范圍和回歸方程

在選定的色譜條件下，β-ODAP色譜峰的峰面積與其濃度在 0.30～50.50μg/mL范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為A1=140.50C1+72.30，r1=0.9995；α-ODAP色譜峰的峰面積與其濃度在 0.10～16.15μg/mL范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為A2=106.60C2+56.00，r2=0.9992。

（五）穩定性試驗

將三七塊根樣品的衍生溶液置于室溫保存，分別于衍生結束后的 0、2、4、6、8、12、16、20、24h進行測定，吸收峰面積的RSD為1.3%，表明樣品溶液24h內穩定。將75.00μg/mLODAP對照品的衍生溶液置室溫下放置7d后進行液相色譜測定，吸收峰峰面積與衍生剛結束無顯著性差異。

（六）精密度和準確度試驗

對75.00μg/mLODAP對照品衍生溶液連續測量11次，保留時間的相對標準偏差為0.8%，峰面積的相對標準偏差為1.5%；平均加樣回收率為98.8%。

（七）樣品測定

在選定的色譜條件下，對不同三七樣品中的β-ODAP和α -ODAP進行測定，結果見表1。

表1 不同三七樣品中β-ODAP和α-ODAP的含量(%，n=3)

三、討論

要想保證整個實驗過程能夠全部落實，還需要保證在實驗過程中采取的實驗試劑能夠符合三七素自身結構狀態。在這個過程中還需要保證三七素分離度能夠達到相應要求。但是在實驗研究中了解到采用β-ODAP和α-ODAP這兩種分離液進行三七素分離過程還存在一定偏差，這就需要采用Gaussian09方法來計算這兩者之間的異構體模式，并選取在不同衍生劑條件下的最低能量結構。在整個色譜柱分析過程中了解到采用β-ODAP和α -ODAP這兩種分離劑進行分離得到的三七素在結構上還存在很大的差異，而且這種差異還會因為其在碳柱上停留的時間發生正向比例變化，也就是說在碳柱上停留的時間越長就會導致這兩者之間的差異越大，加大了三七素分離的難度。

另外在整個過程中三七素和相應試劑所處的條件也會影響三七素自身衍生效果。一般來說在進行三七素衍生結果分析的時候應該保持衍生溫度在30℃-60℃之間，這是因為在超過 60℃的條件下會導致整個三七素衍生過程中的衍生物質明顯降低，其根本原因在于這個時間段內三七素自身狀況還沒有達到穩定的狀態下，很容易發生水解現象。在將發生水解之后的三七素移至常溫下進行實驗操作，發現衍生產物自身吸收峰的面積沒有太大的變化，這就說明在三七素在常溫下的穩定性是最強的。在對不同的衍生條件進行研究中了解到在整個實驗中采取不同的衍生條件對整個實驗結果都會產生一定影響。因此在進行衍生條件選取的時候，需要對整個三七素的結構成分有一個全面了解，促使整個衍生實驗更加順利的進行。

在整個實驗過程中還需要對色譜條件進行合理優化，在使用乙腈-醋酸鹽緩沖溶液的時候會使得整個溶液狀態發生嚴重變化，形成色譜差，造成進行實驗的溶劑瓶自身發生非常嚴重的堵塞現象，針對于這種情況就需要采用乙腈與HAc-NaAc緩沖液結合的方式進行色譜條件優化，保證數據的真實性和有效性。

在上述實驗中了解到在不同三七樣品中都有三七素的存在，但是這些三七素在結構上還存在一定差異。而且現行實驗研究方法還存在很大不足，針對于這種情況就需要在進行三七素研究中對方法中的不足提出有效解決措施。在檢測實驗中還需要按照三七素的相應物質成分選取有效的緩沖溶液對三七素這種物質進行緩沖，保證其自身反向柱相容性能夠符合相應規定。在整個實驗中采用的乙腈-醋酸鹽溶液對于延長實驗色譜柱的使用壽命期到非常重要的作用。另外為了保證三七素分析數據的精準性有一定提升，還需要對整個過程中使用的乙腈-醋酸鹽濃度和可溶性有一個全面考慮，保證其自身狀態能夠全面符合整個實驗的需求。一般來說對乙腈-醋酸鹽的比例應該保持其能夠在10分鐘內重復進樣，這樣對于減少三七素分析時間，提高分析效率起到非常重要的作用。

[1]周桂友，侯艷芳，董新吉.柱前衍生-反相高效液相色譜法測定氨基酸[J]．理化檢驗(化學分冊)，2011，47(8):889-893.

[2]常艷.新藥生殖發育毒性評價及胚胎毒性體外篩檢方法的建立和應用[D]．上海:上海醫藥工業研究院，2005.

[3]張勇.三七素臨床前藥物動力學和雷貝拉唑制劑生物等效性研究[D]．沈陽:沈陽藥科大學，2006.

R284.1

A

1672-5018（2016）10-007-02