聚乙烯亞胺介導Bmk CT基因抑制C6膠質瘤細胞C-Myc、VEGF表達

張亞濤，范麗娜，溫春麗，胡風云*

(1.山西中醫學院，山西 太原　030024；2.山西省人民醫院，山西 太原　030012)

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聚乙烯亞胺介導Bmk CT基因抑制C6膠質瘤細胞C-Myc、VEGF表達

張亞濤1，范麗娜1，溫春麗2，胡風云2*

(1.山西中醫學院，山西 太原030024；2.山西省人民醫院，山西 太原030012)

[摘要]目的：應用陽離子聚合物聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)介導東亞鉗蝎氯離子通道毒素(Buthus martensii Karsch Chlorotoxin-like Toxin，Bmk CT)基因轉染C6膠質瘤細胞，觀察其對C6細胞內C-Myc、VEGF表達的影響。方法：將PEI分別和pEGFP-N1-Bmk CT、pEGFP-N1質粒混合，獲得PEI/pEGFP-N1-Bmk CT和PEI/pEGFP-N1兩種復合物，將其轉染C6細胞，MTS法觀察細胞增殖和存活活力，48 h后通過Western-blot方法檢測C-Myc、VEGF蛋白表達水平。結果：PEI/pEGFP-N1-Bmk CT轉染C6細胞48 h后較PEI/pEGFP-N1能夠顯著抑制C6細胞增殖和存活活力，同時抑制C-Myc、VEGF蛋白表達。結論：PEI/pEGFP-N1-Bmk CT轉染C6細胞可能通過抑制C-Myc、VEGF表達進而抑制C6細胞增殖和血管生成。

[關鍵詞]Bmk CT；膠質瘤；C-Myc ；VEGF

腦膠質瘤在神經外胚層腦腫瘤中最為常見，發生率約占顱內腫瘤的40%。美國癌癥協會統計，美國每年有24 000人被診斷患有這種疾病，大約75%的患者在被檢出的當年死亡[1]。腦膠質瘤具有高浸潤性和侵襲性，與正常腦組織之間沒有明顯界限，手術很難完全切除[2]。蝎氯毒素(chlorotoxin, CTX)能特異性阻斷神經膠質瘤所特有的氯離子通道，進而抑制膠質瘤的遷移和侵襲，同時不影響正常腦細胞[3]。東亞鉗蝎氯離子通道毒素(Buthus martensii Karsch Chlorotoxin-like Toxin，Bmk CT)是CTX的第一個類似物，與其有68%的同源性，具有相似的生物學功能[4]。BmK CT作用于C6細胞可抑制MMP2的酶活性及蛋白分泌水平，進而抑制膠質瘤細胞的侵襲力[5, 6]。純化的重組BmK CT蛋白腹腔注射于C6/SD荷瘤鼠能夠抑制腫瘤細胞的增殖和遷移[7]。BmK CT蛋白獲得困難、價格昂貴，基因轉染是解決途徑之一。本項研究采用非病毒載體陽離子聚合物PEI轉染重組質粒pEGFP-N1-Bmk CT于C6膠質瘤細胞，觀察Bmk CT基因對于膠質瘤細胞C-Myc、VEGF表達的影響。

1材料

C6細胞購于中國協和醫科大學基礎醫學研究所細胞中心。陽離子聚合物聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)購于南京慧基公司。DMEM(GIBCO公司)，FBS(GIBCO公司)，CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS)(Promega 公司)，C-Myc抗體(CST公司)、VEGF抗體(Abcam公司)。

2細胞培養

C6細胞培養采用含10%胎牛血清的DMEM培養基，將其置于37℃、5%CO2(體積分數)、飽和濕度的培養箱中傳代培養。

3實驗方法

3.1MTS實驗

3.1.1基因轉染取對數生長期C6細胞，胰酶消化后接種于96孔板，調節細胞密度為8×103個/孔，分為pEGFP-N1-Bmk CT組和pEGFP-N1組，每組5個復孔。24 h后，進行基因轉染。取0.2 μg pEGFP-N1-Bmk CT質粒和0.6 μL PEI置于30 μLPBS溶液中，混勻，獲得PEI/pEGFP-N1-Bmk CT復合物。同樣方法制備PEI/pEGFP-N1復合物，室溫靜置20 min。兩種復合物中分別加入50 μL完全培養基；棄去96孔板中原有培養基，將兩者分別加入不同組中。6 h后每孔補加120 μL完全培養基。

3.1.2觀察熒光蛋白表達轉染24 h，將細胞在熒光顯微鏡下觀察，拍照。

3.1.3測定OD值 轉染24 h和48 h后每孔加入20 μL的MTS溶液，30 min后酶標儀讀取OD值，波長490 nm。

3.2Western-blot 實驗

取對數生長期C6細胞胰酶消化后接種于6孔板，調節細胞密度為2.5×105個/孔，分為pEGFP-N1-Bmk CT組和pEGFP-N1組。24 h后，進行基因轉染。取2.5 μg pEGFP-N1-Bmk CT質粒和7.5 μL PEI置于200 μLPBS溶液中，混勻，獲得200 μL PEI/pEGFP-N1-Bmk CT復合物。同樣方法制備PEI/pEGFP-N1復合物，室溫靜置20 min。兩種復合物中分別加入500 μL完全培養基；棄去6孔板中原有培養基，將兩者分別加入不同組中。6 h后每孔補加1 500 μL完全培養基。轉染后48 h，每孔細胞中加入含有磷酸酶和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液150 μL，刮掉細胞，冰上裂解30 min，10 000 rpm離心10 min，提取細胞總蛋白。取上清，lowry法進行蛋白定量。進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、濕轉，5%脫脂奶粉封閉1 h， C-Myc、VEGF抗體1∶1 000稀釋，4℃孵育過夜，室溫下孵育二抗1 h，ECL顯影。

4統計學方法

5結果

5.1基因轉染后EGFP蛋白表達情況

pEGFP-N1-Bmk CT和pEGFP-N1轉染C6細胞后，均有EGFP蛋白表達，如圖1，證明基因轉染成功。

圖1　基因轉染后綠色熒光蛋白表達圖

5.2基因轉染后對C6細胞增殖和存活活力的影響

pEGFP-N1-Bmk CT和pEGFP-N1轉染C6細胞后，MTS結果顯示，24 h兩者無統計學差異(P>0.05)，48 h前者能明顯抑制C6細胞增殖和存活活力(P<0.05)，如圖2，證明PEI轉染Bmk CT基因在體外可以抑制C6細胞存活。

5.3基因轉染后C-Myc、VEGF蛋白表達水平變化

pEGFP-N1-Bmk CT和pEGFP-N1轉染C6細胞48 h后，Western-blot檢測結果顯示pEGFP-N1-Bmk CT組C-Myc、VEGF蛋白表達水平顯著下調(P<0.05)，如圖3。

圖2　pEGFP-N1-Bmk CT降低C6細胞增殖和存活活力

圖3　基因轉染后C-Myc、VEGF蛋白表達水平

6討論

手術結合放療和化療的標準治療并不能顯著改善神經膠質瘤患者的生存問題，基因治療膠質瘤作為一種新的治療策略是對膠質瘤治療的有益補充[8]?；蛑委熛鄬τ诘鞍姿幬镏委熆梢越档兔庖咴?，防止蛋白降解，降低成本。非病毒基因載體克服了病毒載體存在的免疫原性高、靶向性差、目的基因容量小等缺點，具備免疫原性低、安全性高、可重復利用的優點[9]。陽離子聚合物PEI具有較強的DNA結合和保護能力，因獨特的“質子海綿效應”被作為陽離子聚合物基因載體性能評價的參照標準[10]。PEI便于進行生物適用性改性，目前改進的生物可降解PEI，能夠降低其毒性。

Bmk CT在體內外均可抑制膠質瘤細胞的增殖[10]，但是對于其中機理的探討尚淺。在本項研究中PEI/pEGFP-N1-Bmk CT轉染C6細胞較PEI/pEGFP-N1能顯著抑制細胞增殖和存活活力(P<0.05)。同時pEGFP-N1-Bmk CT和pEGFP-N1轉染C6細胞48 h后，Western-blot檢測結果顯示pEGFP-N1-Bmk CT組C-Myc、VEGF蛋白表達水平顯著下調，說明Bmk CT基因抑制C6膠質瘤細胞增殖可能與C-Myc、VEGF相關。C-Myc與腫瘤的發生、增殖和分化都有密切關系，C-Myc蛋白具有DNA結合能力，能夠促進DNA的復制[11]。C-Myc在惡性膠質瘤細胞中過度表達[12]。于如同等[13]用C-Myc反義寡核苷酸(C-Myc ASON)注射原位膠質瘤大鼠瘤區，能夠抑制膠質細胞增殖，同時出現較多凋亡細胞。C-Myc蛋白能促使腫瘤細胞由G1期向S期轉化，這促進了腫瘤細胞的增殖。抑制C-Myc蛋白表達就能抑制腫瘤細胞從G1期向S期轉化[12]。VEGF在膠質瘤中存在過度表達[14]。VEGF是目前認為最能直接參與誘導腫瘤血管形成的因子之一[15]。新生血管的生成不僅能促進腫瘤的增長，而且加劇了腫瘤的浸潤和轉移[16]。VEGF可通過增加微小血管的通透性增加血漿蛋白滲出，為新生血管形成提供營養支持，也增加了組織水腫[17]。C-Myc能夠觸發并增加VEGF的表達，它的活性對于維持VEGF的表達是必不可少的。C-Myc基因的缺失可導致血管內皮生長因子的表達降低，血管生成停滯，說明Bmk CT基因可能通過抑制C-Myc，進而抑制VEGF表達水平，抑制膠質瘤細胞的增殖和血管新生。

PEI介導的Bmk CT基因能夠抑制C6細胞增殖和存活活力，降低C-Myc、VEGF蛋白表達水平，顯示出良好的治療前景，為膠質瘤的治療提供了新的途徑。

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本文編輯：王知平

Expression of Polyethyleneimine-mediated Bmk CT Gene Inhibitation to VEGF and C-Myc in C6 Glioma Cells

ZHANG Yatao1,FAN Lina1,WEN Chunli2,HU Fengyun2*

(1.ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Taiyuan030024,ShanxiProvince,China;2.ShanxiProvincialPeople'sHospital,Taiyuan030012,ShanxiProvince,China)

[ABSTRACT]Objective:To investigate the effects of PEI (polyethyleneimine)-mediated Bmk CT (Buthus martensii Karsch Chlorotoxin-like Toxin)，Bmk CT gene transfection on the expression levels of C-Myc and VEGF of C6 glioma cells.Methods:pEGFP-N1 and pEGFP-N1-BmK CT were combined with PEI to form the composites, PEI/pEGFP-N1-Bmk CT and PEI/pEGFP-N1, which were used to transfect C6 glioma cells.Then, MTS test was performed to investigate the proliferation and viability of the transfected cells.After 48 hours the expression of C-Myc and VEGF proteins were detected by Western-bloting.Results: The proliferation of C6 glioma cells in the pEGFP-N1-Bmk CT group was significantly inhibited, while the expression levels of C-Myc and VEGF were lower than pEGFP-N1 group after the transfection.Conclusion: PEI/pEGFP-N1-Bmk CT may suppress the angiogenesis and the proliferation of C6 glioma cells through inhibiting the expression of C-Myc and VEGF.

[KEYWORDS]Bmk CT; Glioma; C-Myc; VEGF

[中圖分類號]Q78

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-0126(2016)01-0007-04

[作者簡介]張亞濤，男，中醫內科學中醫藥防治腦病方向碩士研究生在讀[通訊作者]胡風云，女，主任醫師，E-mail:fengyun71@163.com