Gene X-pert Mtb/RIF檢測技術與抗酸染色和BD960培養、藥敏的比對研究

布紅麗，張　麗，智霞萍，楊順利

(太原市第四人民醫院，山西 太原　030053)

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·臨床醫學·

Gene X-pert Mtb/RIF檢測技術與抗酸染色和BD960培養、藥敏的比對研究

布紅麗，張麗，智霞萍，楊順利

(太原市第四人民醫院，山西 太原030053)

[摘要]目的：評價Gene X-pert Mtb/RIF檢測痰標本診斷結核病和結核菌對利福平耐藥的效能。方法：采用2014年10月～2015年7月太原市第四人民醫院收集的確診結核病患者的痰標本進行涂片、BD960培養、BD960藥敏試驗及Gene Xpert Mtb/RIF檢測，應用統計學方法對Gene Xpert Mtb/RIF與不同檢測方法進行敏感度分析。結果：Gene X-pert Mtb/RIF檢測技術敏感度均高于涂片和BD960培養(P<0.05)，利福平耐藥與BD960利福平耐藥無統計學差異(P>0.05)。結論：Gene Xpert Mtb/RIF檢測技術是一種快速、自動化程度高、操作簡便的結核病分子生物學診斷技術，為臨床快速診斷結核病及是否對利福平耐藥提供了有力的實驗室佐證。

[關鍵詞]結核病；涂片；Gene Xpert Mtb/RIF檢測；BD960培養

1資料與方法

1.1一般資料

收集太原市第四人民醫院2014年10月～2015年7月住院的結核患者200例，男110例，女90例；其他呼吸道(非結核病)疾病患者30例，其中肺癌患者8例，支氣管擴張10例，慢性阻塞性肺病12例。

1.2儀器、試劑

抗酸染色液生產廠家為珠海貝索生物技術有限公司；培養及藥敏所用儀器為美國碧迪醫療器械有限公司生產的BACTEC MGIT960全自動分枝桿菌檢測系統，試劑均為BD960配套試劑，由碧迪醫療器械有限公司提供；Gene Xpert Mtb/RIF儀器及試劑由美國Cepheid公司提供；結核桿菌標準菌株由國家CDC結核病參比實驗室提供。

1.3研究方法

1.3.1涂片抗酸染色涂片抗酸染色按照《痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》的要求操作。

1.3.2培養及菌種鑒定同時進行BD960液體快速培養，培養陽性標本再進行BD960藥敏試驗，操作如下：痰液標本的前處理：a) 挑去5 mL痰液至50 mL已標記的離心管中；b) 加等量的2%NALC-NaOH前處理液，強力旋渦振蕩20 s；c) 室溫靜置15～20 min；d) 加無菌PBS(PH6.8)至約50 mL，蓋緊蓋子，離心3 000轉，15 min，倒掉上清液；e) 添加1～3 mLPBS(PH6.8)以制備成懸濁液。標本接種：標本接種前，在MGIT 7 mL培養管中先加入0.8 mLGrowth Supplement溶解后的PANTA(雜菌抑制劑)；接種0.5 mL處理后的標本至BBL MGIT培養管中，然后上機檢測，報告陽性者同時做涂片抗酸染色確認，注意涂片染色陽性的分支桿菌并不都是結核菌，只是抗酸染色陽性。陽性同時做菌種鑒定，接種在濃度為50 μg/mL對硝基苯甲酸培養基上。

1.3.3藥敏試驗報陽1 d或2 d，無需稀釋，顛倒混勻后準備直接接種，報陽第3天至第5天。取1 mL陽性肉湯到4 mL無菌生理鹽水，混勻(1∶5稀釋)，加0.8 mLBACTECTM MGITTM960 SIRE添加劑至每一試管，加100 μL利福平藥物至標記好的MGIT管，再加入菌液0.5 mL，將準備好的MGIT管放入標記好的AST試管架，并按放管程序放入BACTEC MGIT960儀器中進行檢測。

1.3.4Gene Xpert Mtb/RIF檢測至少收集1 mL痰液樣品，裝入50 mL離心管中，加入Gene Xpert樣品試劑2∶1，蓋好蓋子，劇烈搖動10～20次，室溫培養15 min，使用試劑盒提供的專用無菌移液管，將液化的樣品吸入，直至彎月面在移液管的最低標記處，打開檢測盒子，將處理好的樣品由檢測盒的加樣孔緩慢加入，不要產生氣泡，確保蓋子蓋緊，將樣品反應盒放入Gene Xpert儀器的樣品艙中進行DNA的提取、PCR擴增和結果的檢測，通過專用軟件判讀結果。

1.4統計學方法

采用SPSS20.0統計軟件進行χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1診斷情況

200例住院患者按照《肺結核診斷和治療指南》(中華醫學會結核病分會)診斷為結核病患者[1]，30例診斷為非肺結核病患者。

2.2細菌學檢測結果

200例住院患者痰涂片顯微鏡檢查，其中涂片陽性68例(34%)，涂片陰性132例(66%)，結核桿菌標準菌株涂片陽性。其中192例住院患者進行BD960培養(8例由于其他原因未進行BD960培養培養)，陽性結果108例(56.25%)，培養陰性結果84例(43.75%)，結核桿菌標準菌株培養陽性，經菌種鑒定為結核分枝桿菌的191例，非結核分枝桿菌1例。107例結核分枝桿菌培養陽性患者進行BD960藥敏試驗(1例非結核分枝桿菌未做BD960藥敏試驗)，對利福平耐藥32例(29.9%)。30例非結核患者涂片抗酸染色鏡檢陽性1例，經PNB菌種鑒定為非結核分枝桿菌；陰性29例，BD960培養陽性0例，陰性30例。

2.3Gene Xpert Mtb/RIF檢測結果

200例住院患者經Gene Xpert Mtb/RIF檢測陽性結果136例(68%)，陰性結果68例(32%)，30例非結核病患者經Gene Xpert Mtb/RIF檢測陽性結果1例，陰性29例，結核桿菌標準菌株檢測陽性。經Gene Xpert Mtb/RIF檢測136例陽性結果中利福平耐藥45例(33.1%)，BD960藥敏試驗利福平耐藥患者32例， Gene Xpert Mtb/RIF檢測均耐藥(見表1)。

表1　Gene Xpert Mtb/RIF檢測結果　　例

2.4Gene Xpert Mtb/RIF檢測靈敏度和特異度比較分析

200例肺結核患者中，陽性136例，提示該方法敏感度為68%(136/200)，30例非結核患者中陰性為29例，表明該方法的特異度為96.67%(29/30)(見表1)。

2.53種方法檢測結果分析

200例住院患者進行涂片檢查，涂片陰性132例，涂片陽性68例，陽性率34.00%，其中192例患者做了BD960結核菌培養，陰性84例，陽性108例，陽性率56.25%，與Gene Xpert Mtb/RIF檢測結果比較，陽性率差異有統計學意義(χ2=36.70,P<0.05)。BD960利福平耐藥測定和Gene Xpert Mtb/RIF耐藥測定兩組比較差異無統計學意義(χ2=2.11，P>0.05)(見表2)。

表2　3種方法檢測結果比較分析　　例

3討論

由于分枝桿菌培養及其核苷酸擴增的技術較為復雜，全球“僅少數”患有耐藥肺結核的患者可獲得充分敏感的診斷性檢測和藥物敏感性測試。全球范圍內，無效的肺結核檢測、不斷增長的多藥耐藥和廣泛耐藥的肺結核致使在肺結核流行的國家需要大力提高結核桿菌的培養和耐藥性檢測能力[2]。

Xpert MTB/RIF 核酸檢測采用Cepheid公司Gene xpert檢測系統，是世界上唯一的全自動一體化實時定量PCR體外診斷技術；全自動醫用PCR分析系統能自動完成并整合以下過程；核酸提取，擴增以及目標序列，在單或者復雜樣品中的檢測，采用一次性特定分析用Gene xpert檢測盒制備和處理樣本，將是樣本和所需試劑加入到檢測盒中，然后將試劑盒放到一個可用的設備模塊之中。Xpert MTB/RIF檢測技術針對rpoB基因81bp利福平耐RRDR區間設計引物，探針，檢測其是否發生突變進而用于診斷患者是否結核以及是否利福平耐藥(rpoB序列存在突變)[3]。本研究Gene xpert檢測結核桿菌敏感度均高于痰涂片和BD960培養，利福平耐藥率與BD960檢測利福平耐藥率比較，無統計學差異(P>0.05)。利福平作為重要的抗結核藥物，被世界衛生組織推薦為治療結核病的一線藥物，耐利福平結核病危害嚴重。世界衛生組織將同時對利福平和異煙肼耐藥的結核病稱為MDR—TB，MDR—TB治療時間長，治療難度大，治療費用高，治愈率低，已成為結核病控制的難題。Xpert MTB/RIF 核酸檢測全程只需2.5 h，與也屬于快速培養的BD960比較，檢測結果更加快速，可以在第一時間診斷患者是否結核及是否對利福平耐藥，為結核病的早期快速診斷提供了實驗室的診斷依據。因此，世衛組織遏制結核病司司長Maoio Rarig lione博士評價Xpert MTB/RIF檢測方法是全球結核病診斷和治療方法的一個重要里程碑，為患結核病和耐藥結核病危險的數百萬人帶來了新希望。但是該方法也有它的局限性，僅能檢測利福平耐藥，缺乏對異煙肼耐藥的檢測，不能快速診斷出MDR-TB，且儀器及試劑均很昂貴，這些均會限制其應用。

總之，Xpert Mtb/RIF檢測操作簡單、快速,不易造成交叉污染，對生物安全性要求很低并且檢測敏感度高于涂片鏡檢法，BD960液體培養，同時該方法可以診斷患者是否對利福平耐藥,在我國結核病實驗室診斷方面具有非常好的應用前景。

[參考文獻]

[1]中華醫學會結核病分會.肺結核診斷和治療指南[J].中華結核和呼吸雜志,2001,24(2):70-74.

[2]胡忠義.結核病耐藥檢測技術進展及存在的問題和對策[J].中國防癆雜志,2014,35(11)：865-867.

[3]李輝，譚耀駒，李洪敏，等.利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術的診斷效果對比研究[J].中國防癆雜志,2014,36(6)：472-476.

本文編輯：王知平

The Comparison Research on Gene X-pert Mtb/RIF Detection Technology and Acid Fast Stain and BD960 Culture and Drug Sensitivity

BU Hongli,ZHANG Li,ZHI Xiaping,YANG Shunli

(TheFourthPeople'sHospitalofTaiyuan,Taiyuan030053,Shanxi,China)

[ABSTRACT]Objective: To evaluate the efficiency of Gene X-pert Mtb/RIF detection of sputum specimens diagnosis of TB on drug resistant tuberculosis bacterium of rifampicin.Methods: The sputum specimens diagnosed cases of tuberculosis patients from Oct.2014 to July 2015 were conducted a smear, BD960 cultivated, BD960 drug sensitive test and Gene X-pert Mtb/RIF detection.The sensitivity analysis based on the a statistical approach were achieved on Gene X-pert Mtb/RIF and the different test methods.Results: The sensitivity of Gene X-pert Mtb/RIF detection technology was higher than the smear, BD960 cultivation(P<0.05). There was no statistically significant difference in the drug resistance of rifampicin and BD960 drug resistance of rifampicin(P>0.05). Conclusion: Gene X-pert Mtb/RIF detection technology is a kind of Tuberculosis (TB) diagnosis technology of molecular biology, which is fast, convenient to use automatically.It provides a powerful laboratory evidence to perform the rapid diagnosis of tuberculosis (TB) and judge whether the rifampicin resistants in the clinic treatment.

[KEYWORDS]tuberculosis (TB); smear; Gene X-pert Mtb/RIF detection; BD960 cultivation

[中圖分類號]R446.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-0126(2016)01-0011-03

[作者簡介]布紅麗，女，副主任技師，從事醫學檢驗工作