插入失活法的應用

【摘 要】質粒是基因工程的常見載體，質粒的結構和重組質粒的篩選和鑒定是高考的熱點問題之一，本文通過分析質粒結構和插入失活法，結合2016年全國卷理綜第40題，探討重組質粒的篩選和鑒定問題。

【關鍵詞】質粒載體；標記基因；插入失活

質粒是基因工程的常用載體，質粒結構和功能也是高考熱點問題之一，2016年全國卷理綜第40題再一次以質粒圖譜為基礎，考查了質粒作為載體應具備的條件，重組質粒導入受體細胞的篩選與鑒定問題，而這一方面的知識在教材中講解較少，理解起來較抽象，難以透徹的掌握這個知識點，給解題帶來困難。本文特針對質粒結構及重組質粒篩選與鑒定問題進行補充，以期能對老師教學和學生解題帶來幫助。

載體是一種可將外源DNA片段送入宿主細胞進行擴增和表達的運載工具。目前已構建成的載體主要有質粒載體、噬菌體載體、病毒載體和人工染色體等多種類型。其中最常使用的是質粒載體。

一、質粒載體

質粒是一種獨立于細菌擬核DNA之外，具有自我復制能力的小型環(huán)狀DNA分子。由于天然質粒作為載體存在著不同的局限性，科研人員對其進行了修飾改造。作為高質量的克隆載體的質粒必須具有如下特征：1.有復制原點，這是質粒在宿主細胞內(nèi)能自主復制的基本條件。2.有多種限制酶的單一識別位點，以供外源基因的插入。3.有標記基因，理想的質粒載體應具有兩種抗菌素抗性基因，以便從平板中直接篩選陽性重組子。4.相對分子質量較小。5.有安全性，作為克隆載體應當只存在有限范圍內(nèi)的宿主；在體內(nèi)不進行重組；不會發(fā)生轉移；不產(chǎn)生有害性狀；不會離開宿主而自由擴散，因而是相對安全的。

二、插入失活

將外源DNA片段插入到載體的標記基因中使此基因失活，喪失其原有的表性特征，稱為插入失活。pBR332是研究最多，應用最廣泛的質粒載體之一，該質粒有兩個標記基因， 四環(huán)素抗性基因（Tetr）和氨芐青霉素抗性基因（Ampr），有8種限制酶識別位點位于Tetr內(nèi)部，另外有2種限制酶的識別位點是存在于該基因的啟動區(qū)內(nèi)，在這10個限制位點上插入外源DNA都會導致Tetr的失活，這時含有DNA插入片段的pBR322將使宿主菌抗氨芐青霉素，但對四環(huán)素敏感。3種限制酶的識別位點位于Ampr內(nèi)，在這些位點插入外源DNA則會導致Ampr的失活，這時含有DNA插入片段的pBR322將使宿主菌抗四環(huán)素，但對氨芐青霉素敏感。插入失活是檢測重組質粒的一種十分有效的方法。

三、實例應用

2016年全國卷理綜第40題是一道很好的考查質粒結構和插入失活效應的題目：

某一質粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因）。有人將此質粒載體用BamHI酶切后，與用BamHI酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化大腸桿菌，結果大腸桿菌有的未被轉化，有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌。回答下列問題：

（1）質粒載體作為基因工程的工具，應具備的基本條件有______（答出兩點即可），而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。

（2）如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化的和僅含有環(huán)狀目的基因的細胞是不能區(qū)分的，其原因是______；并且______和_____的細胞也是不能區(qū)分的，其原因是______。在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌的單菌落，還需使用含有______的固體培養(yǎng)基。

（3）基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為載體，其DNA復制所需的原料來自______。

分析題目可知，本題考查了基因工程質粒載體特點、插入失活效應在重組質粒篩選中的應用及噬菌體侵染細菌后，合成子代噬菌體一切的原料來源于宿主細胞。分別解析如下：

（1）小題考查了質粒作為基因工程的載體應具備的基本條件，參考答案：具有復制原點；具有標記基因；具有限制酶的單一識別位點。

（2）小題考查插入失活及重組質粒的篩選問題，將此質粒載體用BamHI酶切后，與用BamHI酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化大腸桿菌，得到的大腸桿菌表型有四種：未被轉化大腸桿菌，對四環(huán)素和氨芐青霉素都敏感，即AmpsTets表型；含有環(huán)裝的目的基因的大腸桿菌，即AmpsTets表型，含有質粒載體的大腸桿菌，即AmprTetr表型；含有插入了目的基因重組質粒的大腸桿菌，即AmprTets。若用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化的大腸桿菌和僅含有環(huán)狀目的基因的細胞是不能區(qū)分的，其原因是都對氨芐青霉素敏感，都不能存活，都無菌落產(chǎn)生。含有質粒載體的大腸桿菌（AmprTetr）和含有插入了目的基因重組質粒的大腸桿菌（AmprTets）因都能抗氨芐青霉素，都能存活，產(chǎn)生菌落；但因為目的基因重組質粒因插入失活破壞了四環(huán)素抗性基因導致四環(huán)素抗性基因失活，因此可用含有四環(huán)素的固體培養(yǎng)基加以篩選。若是在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能形成菌落而在含四環(huán)素的固體培養(yǎng)基上不能形成菌落，就是我們所要的含有插入了目的基因重組質粒的大腸桿菌。

【參考文獻】

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