PI3K/Akt信號通路在胞內布魯氏菌存活中的作用

張俊波+印雙紅+李默+冉輝+羅靜+李建新+陸安法+郭飛+陳創夫

摘要： 為了檢測對PI3K/Akt信號通路在巨噬細胞內布魯氏菌存活的影響，將布魯氏菌粗糙型菌株RB51和光滑型菌株S2308分別侵染細胞，應用Western blot技術檢測RB51和S2308和對巨噬細胞內p-Akt（S473）和p-Akt（T308）表達的影響；用MTT法檢測抑制劑LY294002（LY）對細胞活性的影響；通過菌落計算法，檢測抑制劑LY對胞內菌RB51和S2308存活的影響。結果表明，粗糙型菌株RB51和光滑型菌株S2308都可激活 PI3K/Akt信號通路，但粗糙型菌株RB51的激活程度顯著弱于光滑型菌株S2308（P<0.01）；抑制劑LY在小于或等于20 μmol/L濃度時不影響細胞活性；抑制劑LY（20 μmol/L）可顯著抑制光滑型菌株S2308的存活，但不影響粗糙型菌株RB51的存活。本研究表明，PI3K/Akt信號通路在光滑型菌株存活中發揮重要作用。

關鍵詞： PI3K/Akt信號通路；布魯氏菌RB51和S2308；胞內存活

中圖分類號： S855.99 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0036-04

布魯氏菌病是一種嚴重危害人類和家畜健康的人獸共患傳染病[1-2]。布魯氏菌為革蘭氏陰性的兼性胞內寄生菌，其急性期的臨床特點主要為惡寒、發熱、關節和肌肉痛等；人感染布魯氏菌后造成骨關節、神經系統、生殖系統和免疫系統等損害，慢性期主要癥狀為骨關節病及包括神經系統在內的多系統多器官的損害，患者一般會表現出神經-精神癥狀，病程較長，容易復發并再感染，從而導致勞動力的喪失。動物布魯氏菌病的特點是生殖器官、胎膜及其他多種器官組織發炎、壞死和肉芽腫的形成，引起流產、睪丸炎及關節炎等癥狀。布魯氏菌病給人類健康和畜牧業和諧發展帶來嚴重危害[3]。因此，研究布魯氏菌及其對宿主細胞的致病機制，為布魯氏菌疫苗研發和防控提供理論依據，對于國民經濟的發展和社會的安全具有重大的意義。

PI3K/Akt信號轉導通路是重要的細胞生存通路之一，Akt作為PI3K/Akt信號轉導通路的關鍵分子，在促進細胞生存、生長、增殖，促進細胞運動、侵襲和轉移，抑制細胞凋亡方面起核心作用[4]。PI3K/Akt信號通路與腫瘤的發生發展密切相關，在多種腫瘤組織有Akt的過度表達和活化。PI3K/Akt 信號通路還與一些病毒的生存繁殖密切相關，然而，PI3K/Akt信號通路與布魯氏菌的生存關系如何，目前尚無相關報道，本研究推測PI3K/Akt信號通路在布魯氏菌致病過程中發揮重要作用，因此，研究PI3K/Akt信號通路在布魯氏菌致病過程中的作用，有助于揭示布魯氏菌的致病機制，為抗布魯氏菌藥物的研制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細胞與質粒 牛種布魯氏菌參考株2308和牛種布魯氏菌疫苗株RB51，由石河子大學人畜共患病實驗室提供；大腸桿菌DH5α，由銅仁學院生物與農林工程學院細胞生物學實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 無內毒素質粒大提試劑盒、增強型 HRP-DAB 試劑盒，購自天根生化（北京）科技有限公司；胎牛血清購自GIBCO公司；細胞轉染試劑LipofectamineTM2000，購自Invitrogen公司；酵母提取物（Yeast Extract）、蛋白胨（Tryptone）、NaCl，購自Oxoid公司；瓊脂糖購自上海生物工程技術有限公司。MTT、DMSO，且以DMSO作為溶劑，購自索萊寶公司；LY 購自碧云天公司；兔抗鼠磷酸化Akt（Ser473）和Akt（Thr308）、Akt單克隆抗體和HRP—羊抗兔二抗，購自Cell Signaling Technology公司；β-actin購自bioworld公司；ECL熒光檢測試劑盒購自Thermo公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自上海生物工程技術有限公司。

1.2.3 布魯氏菌侵染小鼠巨噬細胞RAW264.7 將16M用PBS洗脫菌體，利用細菌比濁法計算數量，按比例通過10倍稀釋菌懸液，然后將懸液涂于固體培養基上，置于37 ℃、10% CO2培養箱中培養3 d，每個稀釋濃度重復3次，進行計數取平均值確定布魯氏菌數目。以50 ∶ 1（細菌個數 ∶ 細胞個數）的比例，用16M侵染RAW264.7細胞，并將侵染后的RAW264.7細胞置于37 ℃ 5% CO2培養箱中繼續培養。

1.2.4 細胞蛋白質提取 細胞計數并收集1×106個細胞，1 500 r/min 離心5 min棄上清收集細胞。加入1×PBS洗滌3次棄上清。細胞沉淀中加入100 μL RIPA裂解液。加入PMSF （100 mmol/L）10 μL/mL、 Na3VO4（200 mmol/L）5 μL/mL、NaF（0.5 mmol/L） 2 μL/mL、phosSTOP phosphatase inhibitor （Roche） 150 μL/mL，細胞懸浮混勻，在冰上靜置 20 min。 4 ℃ 15 000 r/min離心15 min。移出上清置于1支新離心管即為含總蛋白的溶液。

1.2.5 BCA法蛋白濃度測定 吸取50 μL樣品于標記好的試管中。加入1 mL BCA工作液，輕柔渦旋混勻。標準檢測：37 ℃孵育30 min或室溫放置2～16 h。加強型檢測：在60 ℃孵育15 min，將試管冷卻至室溫。在1個干凈的吸光杯中加入1 mL水，在波長562 nm調零。將待測液加入干凈的吸光杯。10 min內測定并記錄所有反應液的吸光度（D562 nm），校正的吸光度為各標樣和試樣的讀數減去空白樣吸光度。結合已知的BSA標樣的量和校正過的吸光度畫出標準曲線。參照標準曲線，根據各蛋白試樣的校正吸光度，在標準曲線的線性范圍內讀出各樣品的蛋白濃度。根據樣品體積和稀釋度計算原來樣品中的蛋白量。

1.2.6 Western blot檢測 當SDS-PAGE結束時，將含有目的蛋白的凝膠切下，盡量避免用手碰觸。同時裁剪6～7張大小和凝膠相同的濾紙和1 張硝酸纖維素膜（NC膜），切除凝膠、NC膜與濾紙 1 角作為標記。將凝膠與NC膜在膜轉移緩沖液中靜置平衡10 min，NC膜與濾紙分開浸泡。 轉膜：將3 層濾紙放于半干式電轉儀中，后放膠，將NC膜放于其上，再鋪3層濾紙，200 mA 20 V 電泳1～2 h。封閉：小心取出NC膜，放在1 個干凈平皿中，用TBST洗膜3次，每次5 min。將NC膜放入雜交瓶中，加入10 mL膜封閉液，37 ℃于雜交儀上封閉1 h。與一抗的結合：倒去封閉液，將NC膜放入盛有TBST的平皿中沖膜3次，每次5 min。將NC膜放入雜交瓶中，加入用TBST稀釋的一抗（1 ∶ 1 000），37 ℃于雜交儀上雜交1～2 h。與二抗的結合：用TBST沖膜3次，每次5 min。加入用TBST稀釋的過氧化物酶標記的山羊抗兔HRP-IgG二抗5 mL（1 ∶ 3 000），37 ℃于雜交儀上雜交1 h。用TBST沖膜3次，每次10 min。加ECL底物顯色液，避光顯色1 min，照相。

1.2.7 LY抑制試驗 取對數期生長細胞，在10% FBS培養基中2 mL細胞以1×106個/mL密度接種于6 孔培養板中。繼續培養6 h后，加入LY，濃度分別選取10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L，1 h后觀察p-Akt（S473）和p-Akt（T308）抑制狀態。將細胞混懸液立即置入液氮以終止反應，然后以冰凍PBS洗滌細胞3次。細胞收集后，采用1×106個/50 μL RIPA提取總蛋白質，BCA法測定總蛋白濃度。

1.2.8 MTT試驗 將抑制劑不同濃度的LY（10、20、40 μmol/L）與巨噬細胞共同孵育，以0.1% DMSO處理細胞為對照。置37 ℃ 5% CO2培養箱，使細胞貼壁培養6～24 h。加入適當濃度的受試化合物，繼續培養適當時間。小心吸取上清，加入90 L新鮮培養液，再加入10 μL MTT溶液，繼續培養4 h。棄去上清，每孔加入110 L Formazan溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶充分溶解，在酶聯免疫檢測儀490 nm 處測量各孔的吸光度。同時設置調零孔（培養基、MTT、Formazan溶解液）、對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、Formazan溶解液），每組設定3復孔。

1.2.9 布魯氏菌的培養、計數 將保存的凍干布魯氏菌接種于10%小牛血清肝瓊脂培養基，置CO2培養箱37 ℃、10% CO2培養4 d，挑取單菌落，接種于斜面培養基繼續培養4 d，加入2 mL生理鹽水，用接種環輕輕刮下斜面培養基上的細菌，以10-1～10-15均勻稀釋細菌，并取200 μL 10-13、10-14、10-15稀釋菌液涂布于120 mmol/L含有10%小牛血清肝瓊脂培養基的平板中，每個稀釋度涂2個平板，置于10% CO2 37 ℃ 的CO2培養箱 4 d，對細菌進行平板計數。

1.3 統計學分析

使用SPSS 17.0數據統計軟件對試驗數據進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 布魯氏菌對PI3K/Akt信號通路的激活

在布魯氏菌RB51和S2308侵染巨噬細胞中，其細胞內對應的p-Akt（S473）與β-actin的灰度值比值分別為 0.32±0.034和1.12±0.045，而對照組值為0.12±0.035。經統計學分析，在粗糙型RB51感染細胞的p-Akt（S473）灰度比值顯著高于對照組（P<0.01），但又顯著低于S2308感染的細胞（P<0.01）。p-Akt（T308）與β-actin的灰度值比值p-Akt（S473）比值趨勢是一致的（圖1）。然后利用抑制劑LY（20 μmol/L）與巨噬細胞作用1 h，然后分別用RB51和S2308侵染巨噬細胞，結果發現，RB51和S2308誘導的 p-Akt（S473/308） 的表達與對照組無顯著差異（P>0.05）。結果表明，在巨噬細胞中，粗糙型的RB51激活PI3K/Akt信號通路的程度極顯著弱于光滑型的S2308（P<0.01），并且抑制劑LY可阻斷布魯氏菌對PI3K/Akt信號通路的激活。

2.2 抑制劑LY對巨噬細胞活性的影響

抑制劑LY和DMSO分別與巨噬細胞作用48 h，MTT法檢測結果：當抑制劑LY的濃度為10 μmol/L和20 μmol/L時不影響細胞的活性，但是在濃度為40 μmol/L時細胞的成活率降至70%。加DMSO后的細胞形態為小圓球形，與正常細胞形態相同，因此對照組加DMSO不影響細胞的活性。加入LY的濃度為10 μmol/L和20 μmol/L時細胞形態也為小圓球形，與正常細胞形態相同，當LY的濃度為40 μmol/L時，細胞變大，形態開始呈不規則形（圖2）。結果表明，采用抑制劑LY的濃度20 μmol/L不影響巨噬細胞的活性，可以進行后續試驗。

2.3 阻斷PI3K/Akt信號通路對胞內布魯氏菌存活的影響

抑制劑LY與巨噬細胞作用1 h，然后，分別用RB51和S2308侵染巨噬細胞，分別在4、12、24 h檢測布魯氏菌的CFU，結果顯示LY處理細胞中RB51的lgCFU與對照組相比無顯著差異（P>0.05）（圖3）；而對于S2308菌株，LY處理細胞的lgCFU與對照組相比差異顯著（P<0.05）（圖3）。結果表明，LY抑制了巨噬細胞內S2308的存活，但對RB51的存活無影響。

3 討論

PI3K/Akt信號通路與很多疾病有關，在細胞內參與調控物質代謝、細胞增殖與存活等生物學行為。PI3K下游靶蛋白Akt具有絲氨酸/蘇氨酸殘基，可直接被PI3K激活。在PI3K途徑中，當上游信號作用于細胞膜表面時，穿膜受體酪氨酸激酶自磷酸化或磷酸化其他底物后，能在細胞膜內表面產生PI3K結合點，PI3K結合后可產生一些磷脂，然后激活Akt，被激活的Akt可介導細胞生長和分化，同時還可提高抗凋亡基因的表達而抑制細胞凋亡，或活化其他信號轉導通路來調控細胞的適應性生存。PI3K/Akt異常激活與體內許多癌癥發生密切相關[5]。p-Akt是Akt的功能活化狀態，Akt只有被激活后才具有生物學功能。p-Akt在大多數腫瘤組織中過度表達。Akt的活化同時需要催化結構域的Th308位點和C端的調節結構域的Ser473位點2個位點的磷酸化，只有2個位點的磷酸化才能使Akt充分活化從而達到最大活化狀態。本研究表明，光滑型菌株（S2308）及可激活p-Akt的Thr308和Ser473 2個位點，充分活化的Akt調控細胞的一系列生理活動；而粗糙型菌株（RB51）也可激活p-Akt的Th308和Ser473 2個位點， 但是與光滑型菌株相比對p-Akt的激活程度顯著下降。對p-Akt的激活程度可能與光滑型菌株的毒力強和粗糙型菌株的毒力弱有關。其具體機制還有待于進一步探索。

LPS是布魯氏菌的經典毒力因子，包括類脂A、核心低聚糖和O抗原或O鏈3個部分。布魯氏菌LPS的生物學活性與傳統的內毒素不同，主要與其特殊的化學結構有關。當布魯氏菌LPS的O-多聚糖缺失時，布魯氏菌從光滑型轉變為粗糙型，導致細菌的毒力減弱，易于被巨噬細胞殺死[6～7]。已有研究表明，脂多糖O-型多糖抑制細胞的吞噬作用，抑制溶酶體溶解和宿主細胞凋亡[8]。布魯氏菌與其宿主細胞最開始的接觸是始于布魯氏菌表面和宿主細胞胞質膜的接觸，脂多糖缺失的突變株毒力較親本株減弱，這說明布魯氏菌LPS在細菌毒力上具有很重要的作用[9]。本研究推測，對 PI3K/Akt 激活的強弱與布魯氏菌致病性成正相關，光滑型布魯氏菌致病性強的原因可能與其LPS能激活PI3K/Akt通路程度較強有關，粗糙型布魯氏菌致病性弱的原因可能與其LPS能激活PI3K/Akt通路程度較弱有關。

LY （PI3 Kinase Inhibitor） 體內是一個高度特異性的抑制劑。它可以特異地抑制 PI3 kinase的活性，但是不抑制其他的脂質和蛋白激酶活性。研究表明LY可以抑制 PI3K-依賴的Akt磷酸化和激酶活性，它通過和ATP競爭PI3K催化結構域的結合位點發揮作用[10]，從而有效抑制其下游蛋白Akt的磷酸化，已被廣泛應用于信號傳導通路的作用及靶向治療的研究中。

布魯氏菌在宿主細胞中的復制和增殖受到各種因素的影響。為了在宿主細胞中復制和增殖，布魯氏菌通過激活宿主細胞內信號通路控制宿主細胞的存活、凋亡和自噬，以逃避宿主免疫應答。已有研究表明，某些病毒為了更加有效地進行復制，通過激活PI3K/Akt信號通路抑制宿主細胞的早期凋亡、促進細胞自噬和抑制細胞免疫以延長在胞內的復制時間[11-13]，甲型流感病毒的NS1蛋白可與PI3K的p85β亞基結合而激活PI3K/Akt。但是PI3K/Akt是否在布魯氏菌感染中起作用尚無文獻報道。本研究發現，LY抑制PI3K/Akt信號通路后，光滑型布魯氏菌S2308存活能力顯著下降，而粗糙型菌株RB51存活力無顯著變化。本研究表明，PI3K/Akt信號通路抑制后主要影響光滑型菌株的生存，其具體機制還有待于進一步探索。

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