分光光度法在食品蛋白質(zhì)中二硫鍵含量測(cè)定中的應(yīng)用

◎ 平秋婷

（廣東省生物工程研究所（廣州甘蔗糖業(yè)研究所），廣東 廣州 510000）

蛋白質(zhì)是一種非常重要的生物大分子，其能夠存在于一切生物體內(nèi)中，是細(xì)胞最主要的一種成分，同時(shí)也是生命體的基礎(chǔ)構(gòu)成物質(zhì)，屬于天然的表面活性劑和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。但蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)卻非常容易因二硫鍵而受到影響，并且蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)還可能致使蛋白質(zhì)的表面活性因此發(fā)生改變[2]。鑒于此，本研究用分光光度法對(duì)食品蛋白質(zhì)的二硫鍵含量進(jìn)行測(cè)定，旨在進(jìn)一步了解蛋白質(zhì)的性能和結(jié)構(gòu)關(guān)系，尤其是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與活性性能之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

從市面上購(gòu)入新鮮豆?jié){。所需試劑有尿素、十二烷基硫酸鈉、EDTA、無(wú)水亞硫酸鈉、濃鹽酸和三氨基甲烷等。所需儀器有pH計(jì)（METTLER TOLEDO，Seven Easy）、紫外可見(jiàn)光光度計(jì)（島津，UV-2550）。

1.2 方法

1.2.1 制備N(xiāo)TSB

取1 mol/L亞硫酸鈉溶液10 mL與100 mg Ellment試劑充分混合，在38 ℃條件下通入氧氣直至顏色從亮紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榈S色，即表示完成NTSB試劑制備。

1.2.2 豆?jié){中二硫鍵含量測(cè)定

①取豆?jié){置于試管中，將試管口堵上，對(duì)其進(jìn)行熱處理。向試管內(nèi)加入20 mL豆?jié){，將塞子擰緊，將其放置在95 ℃條件下進(jìn)行水浴處理，持續(xù)90 min，對(duì)其連續(xù)進(jìn)行3次重復(fù)處理。②各取2 mL（1號(hào)）與4 mL（2號(hào)）樣品，并向其中分別加入18 mL與16 mL丙酮，充分搖勻，放置10 min，再行15 min離心處理，再加入丙酮10 mL行懸浮沉淀處理，再進(jìn)行15 min的離心處理，重復(fù)2次。③取20 mL緩沖液（尿毒8 mol/L，1%SDS，EDTA 3 mmol/L，0.2 mol/L Tris-HC1，0.1 mol/L Na2SO3）加入到1號(hào)處理后豆?jié){中，另取20 mL緩 沖 液（ 尿 毒 8 mol/L，1%SDS，EDTA 3 mmol/L，0.2 mol/L Tris-HC1）加入到2號(hào)處理后豆?jié){中。對(duì)其進(jìn)行充分的振蕩處理，使其能夠完全溶解混合。④分別取 0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL和 1.50 mL的 1號(hào)溶液置于試管中，再對(duì)各試管分別進(jìn)行3次測(cè)試取平均值，取緩沖液（尿毒8 mol/L，1%SDS，EDTA 3 mmol/L，0.2 mol/L Tris-HC1，0.1 mol/L Na2SO3，10 mmol/L 5，5'-二硫代-2-硝基苯甲酸）相同劑量，加入到試管中，再取緩沖液（尿毒8 mol/L，1%SDS，EDTA 3 mmol/L，0.2 mol/L Tris-HC1，0.1 mol/L Na2SO3） 將 其 稀 釋 到3 mL，即可行吸光度測(cè)定。⑤分別取0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL和1.50 mL的1號(hào)溶液置于試管中，再對(duì)各試管分別進(jìn)行3次測(cè)試取平均值，取緩沖液（0.2 mol/L Tris-HC1，10 mmol/L 5，5'-二硫代-2-硝基苯甲酸）0.1 mL加入中，對(duì)其進(jìn)行30 min的振蕩處理，再次向其中加入緩沖液（尿毒8 mol/L，1%SDS，EDTA 3 mmol/L，0.2 mol/L Tris-HC1）將其稀釋到3 mL，即可行吸光度測(cè)定。

1.2.3 巰基和二硫鍵含量計(jì)算公式

當(dāng)pH值達(dá)到8時(shí)，N TB的摩爾消光系數(shù)為13 600 mol/L·cm。

其中，A412nm指吸光度；D用于表示稀釋倍數(shù)×20；C表示豆?jié){固形物的含量；V表示牛奶或豆?jié){的體積[3]。

2 結(jié)果與分析

通過(guò)對(duì)豆?jié){進(jìn)行90 min熱處理，經(jīng)分光光度法測(cè)定結(jié)果顯示，所取得的樣品體積與游離巰基的吸光度表現(xiàn)為較好的線性關(guān)系，并且線性回歸之后即可獲得線性方程式：y=0.168 2x，r2=0.996（見(jiàn)圖1）。

圖1 豆?jié){熱處理90min后游離巰基圖

取得的樣品體積與總巰基含量的吸光度表現(xiàn)為正比，并且線性回歸之后即可獲得線性方程式：y=0.288 8x，r2=0.998（見(jiàn)圖2）。通過(guò)豆?jié){樣品測(cè)試，其含有的二硫鍵含量為8.886 μmol/g。

圖2 豆?jié){熱處理90min后總巰基圖

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)豆?jié){樣品中蛋白質(zhì)二硫鍵含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果證實(shí)，分光光度法所獲得的巰基含量與吸光度均表現(xiàn)為較好的線性關(guān)系，這表明分光光度法用于食品蛋白質(zhì)二硫鍵含量測(cè)定的方法具有可操作性和實(shí)用性[4]，能夠用于了解蛋白質(zhì)性能與結(jié)構(gòu)的關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：

[1]王 芳，包怡紅，于 震.食品中蛋白質(zhì)快速檢測(cè)技術(shù)的研究[J].食品工業(yè)科技，2014，35（11）：372-375.

[2]何保山，王 丹，左春艷，等.用分光光度法快速測(cè)定蛋白質(zhì)含量的研究[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，31（4）：27-29，35.

[3]梁琴琴，李永生.流動(dòng)注射分光光度法快速測(cè)定乳制品中的蛋白質(zhì)含量[J].分析化學(xué)，2011，39（9）：1412-1417.

[4]房列濤，蘭 雪，沈秀軍，等.雙波長(zhǎng)600nm/460nm分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量研究[J].生物學(xué)雜志，2015，32（4）：94-97.