新型乙肝定量PCR試劑檢測性能驗證

徐江霞，龔淑琪，萬振華，鄧連瑞，洪建華(、南昌大學第四附屬醫院檢驗科，江西南昌330003；、江西省口腔醫院，江西南昌330006)

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新型乙肝定量PCR試劑檢測性能驗證

徐江霞1，龔淑琪1，萬振華1，鄧連瑞1，洪建華2
(1、南昌大學第四附屬醫院檢驗科，江西南昌330003；2、江西省口腔醫院，江西南昌330006)

摘要:目的驗證一種新型乙肝定量PCR試劑檢測性能。方法參照ISO15189:2012要求，設計一系列實驗對新型乙肝定量PCR試劑檢測性能評價指標驗證。結果①正確度驗證：比對實驗顯示新型試劑與傳統試劑（上?？迫A）相關性較好（y= 1.0259x+0.4857，R2=0.9534）；新型試劑參加2014年衛生部室間質評正確率100%。②精密度驗證：新型試劑檢測高（106）、低（104）濃度樣本的批內及批間CV值均小于10%。③可報告范圍驗證：新型試劑在102～108范圍內具有較好線性（y=-0.951x+ 9.1937，R2=0.99892>0.99）。④定量檢測限：新型試劑檢測原倍（103）、2倍、4倍稀釋血清的CV值均小于15%，定量檢測限可達到500IU/ml左右。結論新型試劑各項評價指標與廠家聲明一致，符合PCR檢測要求，具有較好的檢測性能。

關鍵詞：正確度；精密度；可報告范圍；檢測限

中國是乙型肝炎感染大國，約有10%的人群為乙肝病毒攜帶者，乙肝熒光定量PCR檢測是用于乙肝疾病診斷及療效的重要指標之一[1，2]。目前國內用于乙肝熒光定量PCR檢測的試劑絕大部分采用傳統的煮沸裂解法提取核酸，其有操作費時、樣本需要量大、易形成氣溶膠造成實驗室污染以及易導致核酸丟失等問題[3]。近年來，一種新型的免核酸提取單管PCR反應開始應用，比如湖南圣湘生物開發的“一步法”乙肝熒光定量PCR檢測試劑，即采用一種先進的核酸釋放技術取代傳統試劑的煮沸裂解法提取核酸，將微量的核酸釋放劑與標本在PCR反應管內混合數分鐘后直接加入PCR反應液進行擴增反應[4，5]。此新技術已獲得國家批準，與傳統試劑相比，具有操作簡便、快速、節約樣本、減少核酸污染及核酸丟失等優點，其應用于臨床將大大提高基因擴增實驗室檢測效率，減少實驗室污染。但目前該技術在我省各大醫院臨床應用尚不多見，其臨床應用的檢測性能仍有待驗證。本研究參照ISO15189：2012[6]中有關“臨床檢驗定量檢測方法的確認和性能驗證”的要求，擬開展一系列臨床評價實驗用于驗證新型“一步法”乙肝定量PCR試劑的檢測性能。根據本實驗室的實際情況，本研究設計驗證的性能指標將包含：正確度、精密度、可報告范圍、檢測限。

1　材料與方法

1.1實驗標本來源本室日常檢測血清標本；混合陰性血清由傳統試劑（上?？迫A）和新型試劑（湖南圣湘）驗證均為陰性的血清樣本混合組成；2014年衛生部臨床檢驗中心HBV DNA室間質評樣本。

1.2儀器及試劑BIO-RAD實時熒光定量PCR儀（CFX-96），乙肝定量PCR試劑（湖南圣湘、上海科華）。

1.3實驗方法

1.3.1正確度驗證⑴比對實驗：取40份日常血清標本（血清標本要求包含陰性、陽性樣本，陽性樣本濃度均勻分布在試劑說明書聲明的檢測線性范圍內），取新型試劑和傳統試劑同時檢測（單次分析），嚴格按照試劑說明書操作，比較兩試劑檢測結果的相關性，繪制直線回歸方程。⑵參加室間質量評價考核：采用新型試劑檢測2014年衛生部臨床檢驗中心10份HBV DNA室間質評樣本，觀察回饋正確率是否與廠家聲明一致（100%）。

1.3.2精密度驗證⑴批內不精密度：在一次擴增實驗中采用新型試劑分別檢測高濃度（106）、低濃度（104）水平血清樣本各一份，每個樣本重復檢測10次，計算均數、標準差及CV值，觀察CV值是否小于廠家聲明（<10%）。⑵批間不精密度：采用新型試劑連續五日重復檢測上述高濃度（106）、低濃度（104）水平血清樣本，計算五日均數、標準差及CV值，觀察CV值是否小于廠家聲明（<10%）。

1.3.3可報告范圍驗證根據新型試劑說明書提供的可報告范圍為5×102～5×109IU/ml，取本室（新型試劑）已檢測到的一高濃度陽性血清樣本（≥108IU/ml），用混合陰性血清10倍梯度稀釋至101左右濃度，采用新型試劑檢測，每個稀釋度重復檢測3次，取均值繪制直線回歸方程，觀察檢測線性范圍是否與廠家聲明一致。

1.3.4檢測限驗證檢測限包括空白檢測限、檢出限、定量檢測限[7]。根據試劑說明書提供的定量檢測限為500IU/ml，本研究主要設計驗證定量檢測限是否與廠家聲明一致。取新型試劑檢測的103左右的樣本，用混合陰性血清按原倍、2倍、4倍、8倍稀釋后，采用新型試劑檢測，每個稀釋度均做3個復孔，計算均數、標準差及CV值。CV值小于1/2允許誤差（15%）對應的濃度水平即為定量檢測限，驗證其是否與廠家聲明500IU/ml的定量檢測限一致。

2　結果

2.1正確度驗證

2.1.1比對實驗比較新型試劑與本室使用的傳統試劑（上?？迫A）對40份日常血清標本的檢測結果的相關性，結果顯示（圖1）兩種試劑檢測結果相關性較好，回歸直線方程為y=1.0259x+ 0.4857，R2=0.9534>0.95，說明兩種試劑具有較好的延續性。

圖1　圣湘試劑與科華試劑比對實驗相關性分析

2.1.2室間質評考核正確率驗證采用新型試劑檢測2014年衛生部HBV DNA室間質評樣本，回報結果（表1）顯示全年10份樣本正確率100%。

2.2精密度驗證

2.2.1批內不精密度新型試劑批內重復性實驗的擴增曲線（圖2）呈光滑的“S”型曲線，樣本擴增效率高且重復性好。定量結果（表2）顯示高濃度（106）和低濃度樣本（104）的批內CV值均小于10%。

2.2.2批間不精密度高濃度（106）和低濃度（104）樣本的連續5日檢測CV值均小于10%。見表2。

表1　2014年我室參加衛生部臨床檢驗中心室間質評回報結果

表2　新型試劑批內及批間不精密度實驗結果

圖2　新型試劑批內重復性試驗

2.3可報告范圍驗證新型試劑檢測梯度稀釋樣本的擴增曲線（圖3）間隔均勻，平滑優美。根據定量結果繪制直線方程（圖4），結果顯示新型試劑在102～108范圍內具有較好線性（y=－0.951x+9.1937，R2=0.99892>0.99）。

2.4定量檢測限驗證新型試劑檢測的原倍（103左右）、2倍、4倍、8倍稀釋后定量結果（表3）顯示：原倍、2倍、4倍稀釋的CV值均小于15%，說明試劑定量檢測限可達到500IU/ml左右。

圖3　新型梯度稀釋實驗擴增曲線

圖4　新型梯度稀釋實驗線性方程

表3　新型試劑定量檢測限驗證實驗結果

3　討論

本研究選擇的性能驗證指標包括：正確度、精密度、可報告范圍和定量檢測限。正確度即評價測量均值與真值的接近程度，本研究依據CLIS EP15-A2[8]文件要求，首先以日常檢測標本為研究對象，采用新型試劑和我室既往使用的傳統方法試劑同時檢測，比較兩種試劑檢測結果偏移是否在可接受范圍。結果顯示兩種試劑具有較好的相關性（R2>0.95），說明新型試劑與傳統試劑具有較好的延續性，可替代傳統方法試劑。再參照文獻[9，10]，以全年衛生部室間質評樣本為研究對象，采用新型試劑檢測，比較檢測均值與回報靶值之間的偏移是否與廠家聲明一致。精密度即多次重復檢測結果的一致性，包括批內和批間精密度。依據CLIS EP05-A2[11]文件要求，結合文獻[10]，本研究設計比較新型試劑對高、低濃度樣本單次實驗中10次重復檢測結果及連續5d重復檢測結果的變異度（CV值）是否小于廠家聲明。可報告范圍即檢測線性范圍，依據CLIS EP06-A[12]文件提供的估計可報告范圍要求，并參閱文獻[9，10]，本研究選擇與廠家聲明的檢測高限接近的高濃度血清樣本，10倍梯度稀釋至與廠家聲明的檢測低限接近的低濃度水平，計算不同濃度水平檢測結果的線性回歸方程。檢測限即檢測靈敏度，根據CLIS EP17-A2[7]文件對檢測限的最新描述，檢測限將包括空白限、檢出限和定量限三個方面。本研究參考溫冬梅[13]等對甲胎蛋白的研究，選擇一低值樣本（103左右）倍比稀釋至試劑說明書給出的定量檢測限接近的濃度，采用新型試劑重復檢測，觀察多次重復檢測結果的變異度是否在可接受范圍，由此驗證新型試劑的定量檢測限是否與廠家聲明一致。本研究通過上述實驗驗證新型試劑具有較好的檢測性能，其擴增效率好，擴增曲線優美平滑；正確度、精密度、可報告范圍及定量檢測限等均與廠家聲明相符。

此外，本研究結果顯示新型試劑定量結果普遍比傳統試劑要高，并且重復性要優于傳統試劑，這與陸金春[4]、李成德[5]、陳雪初[14]、葉劍榮[15]等人的實驗結果相近，分析其原因可能來自以下兩方面：⑴新型一步法試劑DNA提取效率高，樣本核酸全部轉入擴增，DNA沒有任何損失；⑵傳統試劑采用煮沸裂解法提取HBV DNA，提取過程中吸除上清液時很容易帶走核酸，DNA損失較多，導致擴增效率低，定量結果偏低。

參考文獻

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·實驗研究·

(收稿日期2016-01-27；修回日期2016-03-17)

通信作者：龔淑琪，1979年12月出生，女，碩士學位，副主任醫師（臨床免疫學檢驗），研究方向：中藥抗感染免疫。

作者簡介：徐江霞，1965年2月出生，女，碩士學位，主任技師，主要研究方向：臨床免疫學檢驗技術。

基金項目：江西省衛生計生委科技計劃項目（編號：20155359）

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.02.007

中圖分類號：R512.6+2

文獻標識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)02-0149-03