微量血凝及血凝抑制試驗在實際操作中關鍵點解析

張　瑜 張慶霞/北京信得威特科技有限公司吳娟/北京市通州區農業局

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微量血凝及血凝抑制試驗在實際操作中關鍵點解析

張瑜 張慶霞/北京信得威特科技有限公司
吳娟/北京市通州區農業局

在獸醫免疫學實驗中，血凝試驗（HA）主要用來測定抗原的血凝價以及是否存在血凝性抗原，血凝抑制試驗（HI）則作為一種抗體監測技術，廣泛應用于獸醫實驗室監測、獸醫門診、大中型養禽場。在實際應用中，HA和HI試驗可用于病毒分離、鑒定、分型，檢測抗原抗體、免疫鑒定等等，例如：養禽場常常將禽流感、新城疫、減蛋綜合癥等疫苗免疫后的抗體水平，作為衡量免疫程序是否合理的依據。盡管此法操作簡便、快速、準確、實用，但在實踐中也常常由于某些因素的影響，從而使試驗結果不精確，有時甚至無法判定結果。本文主要對HA和HI在實際操作中的關鍵點進行闡述。

一、材料的準備及儀器校準

HA和HI試驗中用到的槍頭、EP管、采血管、PBS必須全部高壓滅菌。注射器必須是新開封，PBS必須在高壓之前標定PH=7.2，單槍、排槍必須校準，確定刻度準確。可重復使用的聚苯乙烯有機玻璃板購買時要注意底角是否為90度，底面是否光滑，清潔，如果不清潔，清洗后可用棉簽蘸酒精把孔底擦干凈。有機玻璃血凝板的好處是可以疊放，在做大批量檢測實驗時節省空間。如使用一次性凝集板，要求試驗前檢查凝集板，剔除有漏洞、形狀不規則、板面有褶皺、有接口、板面和板孔不干凈、不光滑的凝集板。

微量移液器型號的選擇、吸嘴的安裝不當以及取樣時吸嘴外壁是否粘有液體，都會造成移液不準，最終影響試驗結果。微量震蕩器使用時應注意震動不宜過大，時間不能太長，一般震動10秒鐘即可。多塊板同時振動時要注意壓住上板，以防液體濺出而影響結果。

圖1　所需材料及儀器

二、緩沖體系的配置

所用pH7.2、0.01 mol/L PBS緩沖液盡量現用現配，以免因PBS緩沖液配制時間過長、pH值發生變化，使檢測結果不準確。一般情況下PBS配好后不需調節PH值，配好后高壓滅菌，冷藏保存備用。若需要調則用1N 的NaOH調pH到7.2。PBS一經使用，于2℃～8℃保存不超過3周。如果用滅菌生理鹽水代替PBS緩沖液，要求使用前檢查生理鹽水有無沉淀、異物，并要求將生理鹽水pH調制到7.2。

三、雞紅細胞的采取和1％懸液的配置

由于不同個體雞只紅細胞對病毒的敏感性不同從而影響HI效價，所以一般需要采取3只以上公雞紅細胞混合一起用，最好用非免疫公雞，如果用免疫公雞代替，須增加洗滌次數和時間。為了保證紅細胞的穩定性，在紅細胞懸液的制備過程中需掌握好離心速度與時間。紅細胞采集應注意防止污染, 洗滌時要盡量抽凈白細胞膜,配制的紅細胞濃度要準確。進行紅細胞懸液配制吸取沉淀的紅細胞時，要在試管最底部吸取進行稀釋配制，如隨意從沉淀的紅細胞上層吸取將會導致配制的紅細胞懸液濃度偏低，因為最后一次離心洗滌紅細胞后棄去的PBS液會有一些殘留在沉淀的紅細胞上層。配制過程應該加快速度，避免室溫操作過長影響紅細胞質量。

配好的紅細胞懸液4℃保存備用，一般能保存1周，所以每次要根據實際需要來酌情配制，避免不必要的浪費，切忌使用已出現溶血的紅細胞進行試驗。紅細胞懸液要用多少取多少, 使用前一定要搖勻, 保證每一孔中加入的濃度準確一致。

四、四單位抗原的制備

四單位抗原是血凝試驗很重要的關鍵因素，4單位抗原和1 ％紅細胞會因自身效價降低和溶血而影響實驗結果。因此，每次實驗前要根據待測樣品數量計算一下本次實驗需要多少的4單位抗原和1 ％紅細胞，適當配置，避免因多配而引起浪費。試驗所用抗原應是穩定性好、效價高的濃縮抗原。抗原在使用前需作血凝(HA)試驗，根據該抗原的血凝價配制4HAU抗原。每次HI試驗所用4HAU抗原均要現配現用，配好后還應作4HAU抗原校對試驗，以確定抗原配制是否準確。配制出準確的4HAU抗原是血凝抑制試驗成功的首要條件，既不能低也不能高，同一批樣品必須使用同一批4單位，同一批紅細胞，決不能補充。另外，4單位抗原不要反復凍融，也不應該存放時間太長，這樣都會影響抗原質量。

檢驗4單位血凝價是否準確，應將配制好的抗原稀釋液分別以1 ml的量加入生理鹽水1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml和6 ml中，使最終稀釋度為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6和1∶7，然后，從每個稀釋度取液體0.25 ml，加入1％雞紅細胞懸液0.25 ml，再加入生理鹽水0.25 ml，混勻。將血凝板在室溫下放置20～40 min后，如果配制的抗原液為4HA，則1∶4稀釋度為凝集終點；如果4HA高于4個單位，可能1∶5或1∶6為終點；如果較低，可能1∶2或1∶3為終點。應根據檢驗結果作適當調整，使工作液確為4HA。如圖2 所示，C即為合適的4HA，A、B低于4個單位，而D和E高于4個單位。

五、待檢樣品

血樣采集后要及時分離血清，分離后及時測定或放置在4℃冰箱內保存，受檢血清應無溶血、無污染,要力求新鮮，如暫時不測定可冷凍保存。血清使用前要充分搖勻。待檢血清要避免反復凍融，最好4℃保存，3天內完成檢測。血清樣品如果有溶血、膠凍樣現象等應該棄去，動物血清中經常存在非特異性血凝抑制物質，這種抑制物質的濃度可能很高，容易造成假陽性反應，尤其是水禽鴨、鵝的血清，一般應該放置56℃滅活30 min，紅細胞吸附或用胰酶處理等方法解決。如要通過雞蛋來測抗體，卵黃用氯仿抽提后結果更為準確，卵黃加氯仿（卵黃液∶PBS∶氯仿＝1∶1∶2）后混勻室溫放置30 min，3 000 r/min，離心5 min，取上清檢測。卵黃較血清HI 低1～2個滴度。對于樣品數量，中小型雞場0.1％，大型雞場不能少于30份，制備好的血清于4℃冷藏盡快送到實驗室完成檢測。

A：2倍單位；B：3倍單位；C：4倍單位；D：5倍單位；E：6倍單位；F：無抗原對照。圖2　校驗4單位抗原圖示

六、環境溫度與時間

因為每個試驗室的環境溫度各不相同，對于南方北方、有空調和無空調的室溫、冬天夏天室溫等等的濕度溫度均不一樣，一般情況下，室溫和等待時間成反比關系。不能簡單的按照書上說的30min后判定，而應該按照你的陰性和陽性對照的最佳沉淀和凝集時間來判定。因為陰性對照會沉淀，陽性對照會凝集，這個時間是可以隨加樣的準確性和環境的溫濕度而變化的，所以紅細胞加入后判定結果的時間就是你的陰陽性對照成立的那一刻，即為試驗結果出現的時刻。

在環境溫度20℃～25℃，經過20℃ 30分鐘即可讀出抗原效價和血清抗體滴度。當溫度過低，如低于15℃時，出現結果就要慢，往往需要超過40分鐘才能出現清晰的結果。因此，為了在較短的時間內出現結果，應將試驗中的環境溫度控制在20℃～25℃，冬、春季可放入相應溫度的恒溫培養箱進行反應。試驗過程中的環境溫度超過30℃時，試驗結果出現的要快。往往在15分鐘左右就可讀數。一旦時間過長，結果就會消失，使整板無凝集現象，給人一種誤以為效價為0，或抗體滴度為12 log2。故要求試驗環境溫度不得超過30℃，反應20～30分鐘及時讀數，不可長時間拖延讀數時間。另外，抗原與抗體作用時間過長或過短對結果影響較大：過短出現凝集不完全；過長出現洗脫現象。

七、結果的判定

判斷結果時，將微量血凝板傾斜45度，孔底沉淀的紅細胞流動性好，呈淚滴狀流淌。不流淌均為凝集顆粒的為凝集孔，完全血凝的抗原或病毒最高稀釋倍數為凝集價；邊緣無凝集顆粒的為凝集抑制孔，紅細胞凝集被完全抑制的血清最高稀釋度為待檢樣品的凝集抑制價。

試驗中一定要做好對照，結果的判定要嚴格按照對照孔的情況進行，判定界限以100％凝集為標準，HA試驗中，以100％凝集的病毒最大稀釋倍數為該病毒的血凝價；HI試驗中，以100％抑制病毒凝集的血清最大稀釋度為該血清的抗體滴度，讀數過程中不能震蕩搖晃血凝板，以免影響結果。

總之，在進行微量血凝和血凝抑制試驗中，一定要細致耐心，嚴格按程序操作，排除各種干擾因素，發現問題及時糾正處理，以免類似錯誤再次出現，這樣才會獲得滿意的實驗結果以正確評價疫苗免疫的效果及輔助診斷病毒性疾病。