豬瘟的實驗室診斷與預防措施

張永香/福建福州大北農生物技術有限公司 陳海南/湖北襄陽襄州畜牧獸醫局

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豬瘟的實驗室診斷與預防措施

張永香/福建福州大北農生物技術有限公司 陳海南/湖北襄陽襄州畜牧獸醫局

豬瘟俗稱“爛腸瘟”，是一種高度接觸性傳染病，遍布全世界，世界動物衛生組織將此病列為A類傳染病之一，我國也將其列為一類傳染病。該病是由豬瘟病毒(CSFV)引起豬的一種常見烈性傳染病，主要通過呼吸道和消化道傳染，一年四季都可發生，以春夏多雨季節為多，傳播速度快，發病率高，死亡率高。感染豬在潛伏期即可向外排毒；感染強毒株的病豬可持續排毒直至死亡，幸存者持續排毒到產生抗體；中等毒力或低毒力毒株會引起慢性傳染，可持續排毒或間歇性排毒到死亡。我國各地雖然對豬瘟都積極進行免疫，但豬瘟仍時有發生，并且非典型和溫和型豬瘟病例逐漸增多，造成的經濟損失甚為慘重。主要傳播是通過直接或間接與感染野豬或家豬接觸經口鼻傳播，或食入被污染的飼料。種公豬篩選不當，可通過配種將病毒傳播給受配母豬。患病母豬可經胎盤直接感染胎兒，誘發仔豬發病。消毒隔離不嚴，人群被視為豬群之間重要的傳播因素。

一、流行病學

家豬和野豬是豬瘟病毒的自然宿主，病豬和帶毒豬是最主要的傳染源。在自然環境下，傳播途徑為口鼻傳播、精液傳播和胎盤傳播。

二、臨床癥狀

（一）急性型

由豬瘟病毒強毒株引起，潛伏期在24～72 h，臨床上常見，病豬體溫41℃左右，呈稽留熱，喜歡臥地，弓背，走路搖晃或打寒戰，食欲減退甚至廢絕，飲水量增加，部分患豬可發生嘔吐。結膜發炎充血，眼睛有膿性分泌物，流膿性鼻涕。病初便秘，后期出現腹瀉，糞便惡臭帶粘液或血液。鼻端、耳后根、腹部及四肢內側皮膚及牙齦、唇內、肛門等黏膜處出現針尖狀出血，由病初的充血逐漸發展為出血斑或發紺；腹股溝淋巴結腫大。有些病豬出現神經癥狀，磨牙、轉圈、強直及游泳樣，甚至昏迷。公豬包皮發炎，用手擠壓時有渾濁的液體射出，惡臭難聞。懷孕母豬感染低毒力豬瘟病毒可表現為流產、產死胎、畸形胎、胎兒干尸化、弱胎或外觀健康但已經感染的帶毒仔豬。

（二）慢性型

多由急性型轉變而來，體溫時高時低，主要表現為消瘦、貧血，全身衰弱，常伏臥、步態緩慢無力、食欲不振、便秘與腹瀉交替；有的病豬在耳端、尾尖及四肢皮膚上出現紫斑或壞死痂，病程一般在20 d以上，最后死亡，耐過豬成僵豬。

（三）遲發性

多數見斷奶后仔豬及架子豬，癥狀不明顯，較輕微，病情緩和，病程較長，皮膚無出血點。但有瘀血和壞死，食欲不振，排便時干時稀，致死率較高。耐過豬生長發育受阻，母豬耐過后長期帶毒，受胎率低、流產、死胎、木乃伊胎或畸形胎，所生仔豬先天感染，死亡或成為僵豬。

三、病理變化

（一）急性型

白細胞及血小板減少，全身皮膚、漿膜和內臟器官有不同程度的出血；全身淋巴結腫大、多汁、充血、出血，呈暗紅色，切面周圍出血明顯，整個切面成紅白相間的大理石樣紋理或黑紅色外觀；典型癥狀是脾臟邊緣可見缺血性梗死；腎臟表面有密集或散在的大小不一的出血點或出血斑，出血部位以皮質表面最為常見，呈現所謂的“雀斑腎”外觀；盲腸、回盲瓣口及結腸黏膜出現有特征性的偽膜性壞死和大小不一的圓形紐扣狀潰瘍；喉頭、會厭軟骨、膀胱黏膜以及心外膜等也出現出血點或出血斑。

（二）慢性型

全身性出血變化不明顯，主要表現為壞死性腸炎，在盲腸、回盲瓣口及結腸黏膜上形成同心輪狀的紐扣狀潰瘍，突出于黏膜表面，顏色呈褐色，中央凹陷；全身淋巴組織萎縮；有診斷意義的是由于鈣磷失調表現為突然鈣化，從肋骨、肋軟骨聯合到肋骨近端常見有半硬的骨結構形成的明顯橫切線。

（三）遲發性

最典型的病理變化是胸腺萎縮，外周淋巴器官嚴重缺乏淋巴細胞。

四、實驗室診斷

根據臨床癥狀和病理變化可做初步診斷，確診需要進行實驗室診斷。目前已建立了多種對豬瘟抗原的檢測方法，下面主要介紹免疫熒光試驗、病原分離和回歸試驗及瓊脂擴散試驗3種檢測方法。

（一）免疫熒光試驗

此法簡便、快速、檢出率較高，許多國家和地區已將其作為豬瘟的法定診斷方法，此法也是我國進行實驗室診斷的最常用方法之一。

1.直接免疫熒光試驗。采取病料：取早期病豬或死亡豬的扁桃體、淋巴結和脾；中后期病豬取胰臟；病程長的患病豬以采集腎或副腎為宜。制成觸片或冰凍切片，室溫下用丙酮固定15 min，取出立即放入0.01 mol/L pH7.2的PBS中，輕輕漂洗3～4次。取出自然干燥后，盡快進行熒光抗體染色。將豬瘟熒光抗體滴加于切片表面，置濕盒內于37℃作用30 min。取出后放入PBS中充分漂洗，最后用無離子水沖洗，自然干燥。再用0.5 mol/L pH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖甘油封片，置熒光顯微鏡（激發光為藍紫光或紫外光）下檢查。如在扁桃體隱窩上皮細胞內或腎曲小管上皮細胞漿內見有黃綠色熒光斑（強毒株熒光明顯，弱毒株僅有微弱的熒光斑），即可判為豬瘟感染陽性。青灰色或帶橙色為陰性。如反差不明顯，亦可用1％伊文思藍復染，但需注意，復染后不要過度脫色。也可用豬源原代細胞或傳代細胞作單層培養時，加入蓋玻片。當形成單層時，種入病豬脾或其他組織浸出液，培養24～48 h，取出蓋玻片，風干、固定。用熒光抗體染色，方法同上。如細胞胞漿內有亮綠色熒光斑，可判為陽性。

2.間接免疫熒光試驗。在病料組織片上，滴加1∶4抗豬瘟陽性血清，作用30 min后洗滌。再加羊抗豬IgG熒光抗體作用30 min，漂洗、干燥，進行熒光檢查，判定方法同上。此法簡易快速，可在2～3 h內得出結果，檢出率可達91％～100％，但非特異性染色仍是一個值得注意的問題。

（二）病原分離和回歸試驗

這是最經典和可靠的方法。采集病變典型的可疑組織，包括血液或臟器，經研磨、超聲裂解、差速離心提取病毒，一方面可作病原檢測，另一方面再將病毒回歸到健康動物體內，觀察是否出現豬瘟的典型癥狀。本法特異性高、敏感性強，最具診斷價值，但耗時、耗財。

1.病料的采集和處理。應采集扁桃體、脾、腎和回腸末段。扁桃體是豬瘟病毒感染后最先能檢測出病毒抗原陽性的組織，因而扁桃體是急性病例的首選病料。回腸末段則是慢性病例的首選病料。病料應從多個病豬采集。采集的病料不加防腐劑、置低溫環境（冰盒中）中，盡快送到實驗室檢測。實驗室通常采用直接免疫熒光法和接種細胞培養分離病毒的方法進行病原學診斷。用熒光法檢測的病料要新鮮，用于病毒分離的病料還應過濾除菌。

2.病毒分離。用豬腎、睪丸的原代、次代或傳代細胞均可。病料經研磨、離心、過濾除菌后接種細胞培養，細胞不出現病變。通常用熒光抗體法可測出細胞培養中蓋玻片上細胞漿內的病毒抗原，亦可用新城疫病毒強化試驗檢測豬瘟病毒的存在。

3.豬體回歸感染試驗。豬是豬瘟病毒唯一的易感動物，用其作為實驗動物診斷本病是最可靠的方法。將易感仔豬（10～20 kg）分為三組，每組3～5頭。其中，一組接種豬瘟疫苗，另一組皮下注射豬瘟抗血清（1 ml/kg體重）。1周后三組同時接種被檢病料（血毒或病料乳劑1 ml/kg），繼續飼養2～3周。疫苗和抗血清免疫組不發病，未免疫組呈現臨床癥狀和病理變化，即可確診。該試驗結果確實可靠，但此過程需要嚴格的隔離條件，且耗時較長，僅在特別需要（如重要疫情）時及其它診斷方法很難確診時使用。

（三）瓊脂擴散試驗

通常采用雙向雙擴散法，可選用病豬脾、淋巴結做抗原（脾臟較好）。該法是將瓊脂糖按1％濃度加入pH8.6的硼酸鹽緩沖液中煮沸溶解，倒入平皿中，冷卻后置4℃保存。臨用時打孔，最常用的是在凝膠板上作成7孔圖形（中央打1孔，周圍打6孔）。檢測抗原時，在中央孔加入足夠效價的抗血清，周圍孔加已知抗原、陰性抗原和待檢樣品，置濕盒內于37℃孵育。待檢樣品為陽性時，可于24～72 h內出現沉淀線。由于抗原擴散較慢，常需在加抗血清之前2～4 h加入孔中。本法取材方便、操作簡單、易于判定，既可檢測抗原，也可檢測抗體，而且此法在病的急性期檢出率最高，但敏感性低，故一般不采用。

五、預防措施

（一）免疫接種

該病尚無特效藥物，采取免疫預防和及時淘汰感染豬是預防的最佳選擇。可接種的免疫疫苗，有豬瘟弱毒疫苗或與豬丹毒、豬肺疫制成的二聯苗或三聯苗。同時開展免疫監測，了解抗體保護水平。對免疫豬群定期用酶聯免疫吸附試驗或正向間接血凝試驗等方法開展抗體監測試驗，了解免疫豬群是否達到有效保護水平。建立種公豬及種母豬血清監督系統和有效的公豬認證及記錄系統。避免生產出感染仔豬形成惡性循環，應用4倍量豬瘟兔化弱毒疫苗對能繁母豬進行配種前注射，結合檢測淘汰隱性感染豬。

（二）加強飼養管理

加強飼養管理，提高整個豬群的抵抗力。做好豬場的隔離、衛生、消毒和殺蟲工作，減少豬瘟病毒的侵入。在生產區時，飼養員之間避免或盡量減少接觸，減少傳染的概率。購買種豬時，杜絕到疫區購買，嚴格檢疫程序。新進的豬應該隔離觀察21 d，確認是健康的豬之后再進行合群飼養。配種選擇優質種公豬、種母豬，嚴格檢查精液質量，避免生產弱胎、畸形胎。

六、小結

豬瘟被我國列為一類動物疫病，發病急，死亡率高，發現應立即上報，劃定疫區，淘汰感染豬，避免出現大范圍暴發。免疫接種是豬瘟最佳的預防選擇，同時加強飼養管理，提高豬群抵抗力。根據臨床癥狀和病理變化可做初步診斷，確診需要進行實驗室診斷，常用的檢測方法有免疫熒光試驗、病原分離和回歸試驗和瓊脂擴散試驗等，養殖戶可根據實際條件進行實驗室診斷，確保早確診早隔離早淘汰，降低經濟損失。