不同凍存液對無血清BHK21細胞冷凍效果的影響

郭海平 李培林 趙子紅 哈申高娃 郭冠萍/金宇保靈生物藥品有限公司

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不同凍存液對無血清BHK21細胞冷凍效果的影響

郭海平 李培林 趙子紅 哈申高娃 郭冠萍/金宇保靈生物藥品有限公司

在細胞培養技術廣泛用于科學研究領域的今天，細胞株的冷凍保存和解凍復蘇這一基礎技術日益得到重視。冷凍保存是細胞長期保存的唯一方法，有利于減少細胞被微生物污染和細胞之間交叉污染的危險性，減少細胞因傳代培養而引起的遺傳變異和形態改變以及避免有限細胞系出現衰老或惡性轉化。大多數的細胞若無特別的要求，都可冷凍保存于-130℃以下長達多年。動物細胞冷凍保存，為細胞培養工作帶來很大的機動靈活性，降低了人力和物力的消耗。但是細胞經冷凍以后，復蘇后的活力始終是細胞工作者最關心的問題之一，怎么樣才能保證細胞在凍存的過程中受到的損傷最小？怎么樣才能使細胞復蘇后的活力以及細胞形態與冷凍之前的差異最??？這一直是我們努力的方向。近年來，培養基的發展很迅速，從正常血清到低血清的培養基，現在已經推出了無血清培養基甚至是CD培養基，相應就會有低血清細胞，以及無血清細胞。血清在細胞的生長過程中起到了很重要的作用，有很多未知的成分對細胞有重要的影響。而體外培養的細胞在無血清的培養基中，非常脆弱，對各種因素十分敏感，那么在無血清細胞的凍存過程中，怎樣能保證細胞的最高活力，這是一個新的課題。有很多的因素會影響解凍后的細胞的存活率，例如細胞的冷凍密度、凍存液的配方以及冷凍程序，細胞的解凍溫度等都會對細胞的凍存效果有影響。本實驗就凍存液的配方對無血清BHK21細胞活力的影響做了分析，這將會在生產中有一定的指導意義。

一、材料

1.細胞株。BHK21細胞來自金宇保靈生物藥品有限公司。

2.試劑。培養液購自CIBCO公司；新生牛血清購自內蒙古維克生生物科技有限公司；甲基纖維素購自天津博迪化工股份有限公司；臺盼藍購自SIGMA公司；DMSO （D2650）購自SIGMA-ALDRJCH 公司。

3.其它實驗器材和儀器。超凈工作臺(YJ-1450)購自吳江市江南凈化工程有限公司；離心機（DL-5-B）購自上海安亭科學儀器廠；冰箱（SC-276）購自青島海爾電冰柜有限公司；倒置顯微鏡（CKX41）OLYMPUS；液氮罐（YDS-30-125F）購自樂山市東亞機電工貿有限公司；50 ml離心管，凍存管購自corning公司；移液器購自芬蘭雷伯；鑷子、防凍手套、防護面罩、血球計數板、經校驗的溫度計均由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

二、方法

用對照、實驗1和實驗2三種不同的凍存液凍存同一批細胞，在細胞凍存半年后同時進行復蘇，每種凍存的細胞復蘇2支，檢驗凍存效果，計算復蘇活力。重復進行三次凍存實驗。

1.凍存液的配制。對照凍存液：7.5％ DMSO，92.5％培養液；實驗1凍存液：7.5％ DMSO，10％血清，82.5％培養液；實驗2凍存液：7.5％ DMSO，10％甲基纖維素，82.5％培養液。

2.細胞的離心。取對數生長期的細胞，倒入離心管中離心900 r/m，5 min。

3.細胞的分裝及凍存。細胞離心后，棄上清，用已經配制好的3種凍存液重懸細胞，然后分裝入凍存管中，每管1.5 ml。按以下程序進行凍存：4℃放置1 h，-20℃放置2 h，液氮口放置0.5 h，放入液氮中。

4.細胞復蘇。細胞凍存半年后進行復蘇，每種細胞復蘇2支，計算其平均活力。從液氮中取出凍存管直接放入37℃溫水中，并不時搖動使其在1～2 min內盡快融化。融化后離心720 r/m，5 min，棄上清，每支管中加入1 ml培養液，計數，計算其活力。細胞計數：4大格細胞總數÷4×104×稀釋倍數。細胞活力=活細胞數÷細胞總數×100％。

三、結果與分析

1.凍存前細胞的密度和活力。結果見表1，三次試驗的細胞的活力都在95％以上，符合凍存標準。

表1　凍存前細胞的密度和活力

2.復蘇后細胞的密度和活力。結果見表2。

表2　復蘇后細胞的密度和活力

表2結果顯示，共進行了三次凍存實驗，從復蘇活力的平均值來看，對照的復蘇活力三次都是最低的，其中的1次低于90％，而實驗1和實驗2的復蘇活力均比對照的高，均在90％以上，而且實驗1的復蘇活力是最高的。

四、討論

細胞凍存在細胞培養中是一個非常重要的環節，細胞凍存效果的好壞直接影響細胞復蘇后的成活率以及后期的繁殖。尤其是對于無血清BHK21細胞的凍存，無血清的細胞非常脆弱，很容易受到外界因素的影響。本文就不同配方的凍存液來凍存無血清BHK21細胞，復蘇后檢驗其復蘇活力，進行了三次平行試驗，結果顯示，含有血清和甲基纖維素的凍存液凍存的細胞，復蘇后的復蘇活力比對照高?？赡苁怯捎谠诩毎膬龃孢^程中，血清和甲基纖維素起到了一定的保護作用，減少了細胞在凍存過程中受到的損傷，因此表現出細胞的復蘇活力高。因此建議在無血清BHK21細胞的凍存中，凍存液中最好添加血清或甲基纖維素，以提高保護性能。

在本實驗中，涉及到了很多需要細胞計數的工作，但是實驗中的所有數據都是人工計數得出，可能存在人為誤差，對實驗結果有一定影響，但是由于數據都是由固定的人員來做的，可能對實驗結果影響不大，需要以后繼續開展實驗，累積數據。

五、小結

本實驗比較分析了3種不同配方的凍存液對無血清BHK21細胞凍存效果的影響，發現添加血清的凍存液在細胞凍存的過程中比其它2種凍存液有更好的保護效果。

參考文獻(略)

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