厄貝沙坦對乳腺癌MCF-7細胞的增殖抑制作用及對VEGF表達的影響

鐘全強，吳洪文，歐夏妙，蒙　杰，唐景財

(1.廣西醫科大學第四附屬醫院暨柳州市工人醫院，柳州 545005；2.廣西桂林市人民醫院，桂林 541002)

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厄貝沙坦對乳腺癌MCF-7細胞的增殖抑制作用及對VEGF表達的影響

鐘全強1，吳洪文2▲，歐夏妙2，蒙杰2，唐景財2

(1.廣西醫科大學第四附屬醫院暨柳州市工人醫院，柳州 545005；2.廣西桂林市人民醫院，桂林 541002)

【摘要】目的研究厄貝沙坦對乳腺癌MCF-7細胞增殖抑制作用及對血管表皮生長因子(VEGF)表達水平的影響。方法采用噻唑藍(MTT)法檢測厄貝沙坦對乳腺癌MCF-7細胞分別作用24 h、48 h、72 h后的抑制率，用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測厄貝沙坦高、中、低三個劑量(7.2 μg/ml、3.6 μg/ml、1.8 μg/ml)對乳腺癌MCF-7細胞干預前后，乳腺癌MCF-7細胞中VEGF表達水平的差異，以順鉑作為陽性對照組(給藥濃度為5 μg/ml)。結果厄貝沙坦對乳腺癌MCF-7細胞的半數抑制濃度(IC(50))為2.3 μg/ml；厄貝沙坦對細胞增殖有顯著抑制作用，且隨著濃度的增加而增強，三個劑量組與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.05或0.01)；厄貝沙坦作用組中VEGF的表達水平與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.01), 厄貝沙坦高劑量組和順鉑陽性對照組VEGF的表達差異無統計學意義(P>0.05)。結論厄貝沙坦對乳腺癌MCF-7細胞的增殖具有顯著抑制作用，可以下調血管表皮生長因子的表達水平。

【關鍵詞】厄貝沙坦；乳腺癌MCF-7細胞；血管表皮生長因子；抑制作用

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑厄貝沙坦購自浙江華海藥業股份有限公司；順鉑注射液購自江蘇豪森藥業股份有限公司；DMEM培養基、胎牛血清和胰島素均購自杭州四季青生物工程公司：DMEM加1.0 mM丙酮酸鈉，0.1 mM非必需氨基酸和1.5 g/L碳酸氫鈉，添加0.01 mg/ml胰島素和10%胎牛血清。酶聯免疫吸附測定法(ELISA)試劑盒購自江蘇凱基生物科技有限公司；VEGF試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司(2～8℃保存)。

1.1.2試驗細胞乳腺癌MCF-7細胞株由廣西醫科大學附屬腫瘤醫院提供(試驗前，細胞保存于液氮罐中)。

1.1.3儀器MODEL550酶標儀：美國BIORAD公司；CO2培養箱：美國 thermo forma；超凈工作臺：蘇州凈化設備廠；倒置相差顯微鏡：日本Olympus。

1.2方法

1.2.1細胞培養本次試驗所用的MCF-7細胞株經過復蘇后，轉移至培養瓶中，置于37℃，0.5% CO2的細胞培養箱中進行培養，細胞經過胰酶消化，傳代培養后，取對數生長期的MCF-7細胞進行種板，顯微鏡下用細胞計數板進行計數，調整96孔板中細胞濃度約為5000個/孔。

1.2.2噻唑藍(MTT)法檢測細胞存活率以空白培養液組作為空白對照組，分別設置厄貝沙坦高劑量組、中劑量組、低劑量組三個組，給藥濃度分別為7.2 μg/ml、3.6 μg/ml、1.8 μg/ml，順鉑作為陽性對照，給藥濃度為5 μg/ml。MTT法測定厄貝沙坦對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響：采用MTT法檢測厄貝沙坦高、中、低三個劑量組對乳腺癌細胞作用24 h、48 h、72 h后的抑制率，運用MTT法檢測厄貝沙坦三個劑量組干預后對乳腺癌細胞的生長抑制作用，取對數生長期細胞用于試驗，用酶標儀以570 nm/630 nm雙波長測定各組細胞吸光度(A)值，細胞增殖抑制率=(1-實驗組平均A值/對照組平均A值)×100%。重復上述試驗3次，Bliss法計算半數抑制濃度(IC50)值，根據IC50值設定后續試驗的作用濃度。

1.2.3ELISA法測定各組中VEGF的表達采用ELISA法測定各組中VEGF的表達，檢測步驟均嚴格按照試劑盒說明書操作步驟實行，在450 nm測量樣本的吸光度值(A)，測定的最小值為30 pg/ml，其結果按照標準曲線法換算成VEGF的含量(pg/ml)。

2結果

2.1MTT法的測定結果經計算，厄貝沙坦對乳腺癌MCF-7細胞的IC50為2.3 μg/ml。在相同作用時間下(24 h、48 h、72 h)，隨著厄貝沙坦給藥濃度的增加，其對MCF-7細胞增殖的抑制作用逐漸增強(P<0.05或0.01)；在低、中、高三個劑量組，隨著用藥時間的延長，厄貝沙坦對MCF-7細胞增殖的抑制作用也逐漸增強(P<0.05或0.01)，表現出劑量依賴性及濃度依賴性。見表1、圖1。

2.2ELISA法測定各組中VEGF的表達結果試驗分為厄貝沙坦高、中、低三個劑量組和順鉑陽性對照組(5 μg/ml)，測定各組藥物作用下細胞中VEGF的表達水平，以未給藥物培養液作為空白對照組，厄貝沙坦高、中、低三個劑量組作用24 h、48 h、72 h后，分別與空白對照組24 h、48 h、72 h VEGF含量對比，差異有統計學意義(P<0.01)，厄貝沙坦高劑量組和順鉑陽性對照組VEGF的表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1　各組藥物對MCF-7細胞增殖抑制作用

注：與空白對照組比較，aP<0.01；與低劑量組比較，bP<0.05，cP<0.01；與中劑量組比較，dP<0.01；同組與厄貝沙坦作用24 h比較，eP<0.05，fP<0.01;同組與厄貝沙坦作用48 h比較，gP<0.01。

圖1 厄貝沙坦高、中、低三個劑量組對MCF-7細胞增殖抑制作用

表2　各組藥物作用下細胞中VEGF表達水平

注：與空白對照組比較,aP<0.01。

3討論

本研究結果表明：厄貝沙坦對乳腺癌MCF-7細胞的增殖有顯著抑制作用，隨著藥物作用濃度的提高，以及作用時間的延長，其抑制作用呈時間、濃度依賴性，試驗中還測定了厄貝沙坦對MCF-7細胞中VEGF表達水平的調控作用，結果發現：隨著厄貝沙坦給藥濃度的增加，可以顯著下調腫瘤細胞中VEGF的含量，厄貝沙坦高、中、低三個劑量組分別與空白對照組比較差異有統計學意義。據此研究結果推測，厄貝沙坦對MCF-7細胞的抑制作用可能與其下調VEGF因子這一作用機制相關。另外，本研究結果也與國外相關的一些報道相印證，Tanaka N等[6]研究發現，腎素血管緊張素在促進腫瘤細胞的生長中具有重要作用。一些腎素血管緊張素抑制劑，如血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEIs)或血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑在臨床應用后，可能會影響惡性腫瘤的進展。研究者通過對279例接受腎輸尿管切除術的局部上尿路上皮細胞癌(確診后分期為pTa-3NOMO)的病人，在腎素血管緊張素抑制劑和血管緊張素轉化酶抑制劑干預下的預后數據進行回顧性分析，發現未給予RAS抑制劑對降低隨后的腫瘤無轉移生存率是一個獨立危險因素。Mc Menamin UC等[7]研究了ACEIs和血管緊張素受體阻滯劑(ARBs)對腫瘤病人的疾病進展和生存期的關系后發現，使用ACEI/ARB后可以預防乳腺癌的復發和大腸癌的遠處轉移，但更可靠的證據仍需進一步研究。Vinson GP等[8]試驗研究證明：血管緊張素Ⅱ通過AT1受體發揮作用，進而促進腫瘤細胞的增殖及血管生成，這些促進作用可以通過阻斷血管緊張素Ⅱ而受到抑制。有關ACE的表達水平和分布或AT1受體在許多腫瘤疾病的差異表達的流行病學證據直接支持了這一研究結論，該結果也為使用高劑量的血管緊張素轉化酶抑制劑和AT1(或AT2)受體阻滯劑在乳腺癌的治療中提供可行性，但這些結論仍有待進一步深入研究，最近的研究主要集中在AT1受體介導的細胞內的信號調控通路。Napoleone E等[9]研究發現：RAS可以促進腫瘤細胞的增殖和血管的生成，ACEIs和血管緊張素Ⅱ-1受體阻滯劑有預防腫瘤的可能性，組織因子(TF)在腫瘤的進展與腫瘤的生長、血管生成及轉移等過程相關。AT1受體競爭性抑制劑氯沙坦可以降低MDA-MB-231細胞中TF和血管生長因子的表達水平，從而對腫瘤的進展和預后產生影響。

本試驗結果表明：血管緊張素-Ⅱ受體抑制劑厄貝沙坦可以顯著下調腫瘤細胞中VEGF因子的表達水平，它對MCF-7乳腺癌細胞的增殖抑制作用很可能與這一下調機制相關，由于腫瘤細胞中血管的生成及腫瘤的形成轉移都和VEGF因子相關[10]，因此VEGF因子可作為評價抗腫瘤藥物治療效果的指標，而本研究中的厄貝沙坦有望為臨床進一步聯合用藥進行抗腫瘤治療提供新的方向。

參考文獻

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(編輯：潘明志)

Influence of Irbesartan on expression of VEGF and its inhibition effect on the proliferation of MCF-7 in breast cancer

ZHONGQuanqiang1,WUHongwen2▲,OUXiamiao2,MENGJie2,TANGJingcai2

(1.TheFourthAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity—LiuzhouWorker'sHospital,Liuzhou545005; 2.ThePeople’sHospitalofGuilin，Guilin541002,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of Irbesartan on expression level of VEGF (vascular epidermal growth factor) and its inhibition effect on the proliferation of MCF-7 in breast cancer. MethodsThe MTT method was used to detect the inhibition rate of irbesartan on the MCF-7 cells after effecting 24 h, 48 h and 72 h, respectively. Enzyme-linked immunoabsorbent assayed(ELISA) was used to detect the level of VEGF in MCF-7 cells influenced by the combination use of irbesartan(the dose of irbesartan were divided into high-dose, middle-dose and low-dose which was 7.2 μg/ml, 3.6 μg/ml and 1.8 μg/ml, respectively). Cis-platinum was taken as positive control group (concentration of drug was 5 μg/ml). Results The 50% inhibition concentration(IC(50))of irbesartan on MCF-7 was 2.3 μg/ml. Irbesartan can inhibit the MCF-7 cancer cells significantly, the inhibiting effect was enhanced while increasing the inhibitor's dosage, difference between the three dosage groups and the blank control group was statistically significant(P<0.05 or 0.01). Difference of expression levels of VEGF between the irbesartan effecting groups and blank control group was statistically significant(P<0.01), but difference between high-dose group and cis-platinum positive control group was not statistically significant(P>0.05).ConclusionIrbesartan can inhibit the proliferation of MCF-7 cancer cells in breast cancer significantly, and lower expression levels of VEGF.

【Key words】irbesartan; MCF-7 cells in breast cancer; VEGF; inhibition effect

(收稿日期：2015-11-04修回日期：2016-02-25)

中圖分類號：R739.9

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2016.01.005

作者簡介：鐘全強，男，主管藥師，碩士研究生。E-mail:zhongquanqiang@126.com▲通信作者：吳洪文。E-mail:wuhongwen5918@163.com

基金項目：廣西壯族自治區衛生廳科研計劃課題(Z2014682)

國內外眾多研究表明：血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是調節腫瘤細胞中血管生長的重要因子之一。腎素-血管緊張素系統(rennin-angiotensin system，RAS)是體內調節水鈉潴留的重要系統，是人體內重要的體液調節系統。最近的研究表明：腎素血管緊張素在多種腫瘤疾病進展過程中發揮著重要作用，血管緊張素與腫瘤疾病的進展具有高度相關性[1～3]。許多腫瘤細胞組織中VEGF高表達，癌細胞能自身合成VEGF；而RAS與VEGF表達呈正相關[4，5]。本文探討血管緊張素Ⅱ受體抑制劑厄貝沙坦對乳腺癌MCF-7細胞的增殖抑制作用和對VEGF因子表達的影響，為臨床抗腫瘤靶向治療提供理論參考。