油棕體細胞胚的誘導和次生胚的增殖研究

鄒積鑫　潘登浪　林位夫

摘 要 油棕體細胞胚的誘導是油棕體胚發生技術體系中最關鍵的培養過程，通過建立油棕次生胚增殖培養方法可有效地實現油棕組培苗快速的增殖繁育。本研究通過系統的對油棕體細胞胚發生及次生胚再生途徑中若干影響因子的比較研究，建立油棕體細胞胚和次生胚再生體系。結果表明：油棕體細胞胚再生體系在不同基因型的油棕品種內誘導率存在較大差別，其中植物外源激素二氯苯氧乙酸（2，4-D）對油棕胚誘導效果較好；油棕次生胚增殖在不同基因型的油棕品種內差異不顯著，木本植物培養基（WPM）在油棕次生胚增殖中培養效果最好。

關鍵詞 油棕 ；體胚發生 ；胚狀體 ；次生胚

中圖分類號 S565.9 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.08.006

Abstract Induction of oil palm somatic embryogenesis is the most critical cultural process in oil palm tissue culture. Rapid proliferation of oil palm can be effectively realized through the establishment of oil palm secondary embryogenesis regeneration in tissue culture. Several factors that affecting induction of oil palm somatic embryos and regeneration of secondary embryogenesis were compared systematically to establish a secondary oil palm somatic embryo regeneration system. The results showed that there is great difference in induction rate of somatic embryogenesis between different oil palm genotypes， and the woody plant medium （WPM） is the best basic medium in proliferation of oil palm secondary embryos.

Keywords oil palm ； somatic embryogenesis ； embryo ； secondary embryogenesis

油棕是世界上重要的熱帶木本油料作物，通過組培可對獲得的優良單株進行快速繁殖，從而大幅度縮短育種、育苗時間。次生胚發生途徑是指由原始體胚細胞（originally formed somatic embryos）或者初生胚狀體（primary somatic embryos）發育獲得體細胞胚的植物再生途徑，許多植物在通過體胚發生途徑獲得離體再生植株過程中，初生體細胞胚的萌發率非常低，遠遠低于次生胚狀體的萌發率。因此通過建立高頻的次生胚狀體途徑獲得離體再生植株的研究在單子葉和雙子葉植物組織培養技術研究中都有廣泛的報道。李洪清等[1]以木薯成熟的胚狀體子葉為外植體材料建立次生胚再生體系，每個外植體材料可獲得32.5個次生胚狀體。孫艷香等[2]以苜蓿無菌苗下胚軸為外植體材料建立次生胚再生體系，篩選獲得2個具有較強次生胚發生能力的株系。Giridhar等[3]以咖啡的葉片和莖為外植體材料建立植株再生體系，通過MS培養基添加三十烷醇成功獲得高頻的咖啡的次生胚。油棕組織培養技術最早由法國科學家Rabechault等[4]于1976年研究獲得成功，隨后在東南亞地區、南美洲地區的多家研究機構和公司有成功的報道[5]。目前馬來西亞、印度尼西亞、哥斯達黎加等國已經開始油棕組培苗的商業化生產[6]。在20世紀80年代中國已有開展油棕組織培養相關的研究。崔元芳等[7]以油棕胚為外植體材料獲得愈傷組織并建立植株再生體系。龔崢等[8]以油棕葉片為外植體材料成功獲得愈傷組織。鄒積鑫等[9]以油棕葉片為外植體材料建立植株再生體系并獲得完整植株。雖然目前國內相關的研究已經取得了較大進展，但尚未得到廣泛的應用和系統的研究，特別是不同油棕單株的體胚發生效率不一致，影響植株再生頻率較低。鑒于此，本研究以前期建立的油棕離體再生體系為基礎，對油棕3個品系優株的胚狀體誘導及次生胚的增殖開展研究，旨在篩選獲得最佳的油棕體胚及次生胚的增殖方法。

1 材料與方法

1.1 材料

以油棕易碎胚性愈傷組織為材料。油棕母樹來自農業部儋州油棕種質資源圃，品種為RYL2、RYL4、RYL6，材料來源是由油棕幼嫩的葉片培養獲得，詳細方法參照鄒積鑫等[11]采用的愈傷組織誘導方法。愈傷組織誘導是將葉片接種到MS培養基（添加5 mg/L 2，4-D、10 mg/L TDZ和質量分數為3%的蔗糖）獲得，再將愈傷組織接種到MS培養基（添加0.1～1.0 mg/L 2，4-D）中獲得易碎胚性愈傷組織。所有的培養基均添加6 g/L的瓊脂，并將pH調至5.8，121℃高壓滅菌15 min。 易碎胚性愈傷組織在光照培養條件下培養，溫度為（28±2）℃，每1個月繼代1次。

1.2 方法

1.2.1 油棕初生胚狀體的誘導

選擇3種不同品系的油棕愈傷組織接種到油棕初生胚狀體培養基中進行誘導培養，基本培養基為木本植物培養基（WPM），并附加4種不同種類的植物激素：二氯苯氧乙酸、毒莠定、麥草畏、萘乙酸，其濃度為1 mg/L，每個處理50個，重復3次。將接種好的培養物置于光培養室中培養，培養溫度為（28±1）℃，光照強度為3 000 lx，光照時間為12 h/d，每2個月繼代培養1次，統計培養1～4個月的出胚情況，每月統計1次。

1.2.2 油棕次生胚狀體的誘導及增殖

將培養2～4個月后的油棕初生胚狀體切分成8～12 mm小塊，接種到培養基中進行次生胚狀體的誘導和增殖。基本培養基為MS、WPM、Y3培養基（附加2，4-D 0.1 mg/L和200 mg/L椰子水），每處理重復3次，培養溫度為（28±1）℃，光照強度為3 000 lx，光照時間為12 h/d，每2個月繼代培養1次，每月統計次生胚狀體的生長情況。

2 結果與分析

2.1 不同培養因素對油棕胚狀體誘導的影響

愈傷組織接種至初生胚狀體誘導培養基后，培養1個月開始觀察到愈傷組織逐漸膨大（圖1-A），分化成心形胚組織，接著心形胚組織繼續分化，頂部不斷變尖成魚雷型胚組織，最終形成芽的前體組織（圖1-B）。品種、植物激素種類以及培養時間的多元方差分析和多重比較結果見表1、2。3個因素對油棕胚狀體誘導的影響效果為：植物激素種類>品種>培養時間，其中4種植物激素的種類對油棕胚誘導率的影響達顯著差異，不同油棕品種胚狀體培養4個月后平均誘導率為2.5%～11.83%。RYL02材料中，植物激素對胚狀體誘導率效果為：二氯苯氧乙酸>毒莠定>麥草畏>萘乙酸。RYL04材料中，植物激素對胚狀體誘導率效果為：毒莠定>二氯苯氧乙酸>麥草畏>萘乙酸。RYL06材料中，獲得的平均出胚率最高達11.83%，植物激素對胚狀體誘導率效果為：二氯苯氧乙酸>毒莠定>麥草畏>萘乙酸。3個不同品種對油棕胚誘導率的影響達顯著差異，其中RYL2品種與RYL4品種間無顯著差異。油棕胚的出胚率隨時間的增加而增加，但不同時間培養對油棕胚誘導率無顯著差異。

2.2 不同培養因素對油棕次生胚誘導的影響

初生胚接種到次生胚培養基后，在胚狀體表面開始形成小的突起，突起不斷的生長變大，形成白色次生胚狀體，次生胚狀體繼續分化形成魚雷型胚，然后逐漸形成芽的前體（圖1-C、1-D）。培養2個月后不同處理產生的次生胚個數為14.0～31.6個，RYL02在M3培養基中獲得的次生胚數最高為31.6個，RYL04在M3培養基中獲得的次生胚數最高為29.6個，RYL06在M2培養基中獲得的次生胚數最高為31.6個。對品種、培養基類型、培養時間的多元方差分析和多重比較分析結果見表3、4。在誘導次生胚的培養過程中，培養基的種類對次生胚誘導的影響達顯著差異，而品種類型對次生胚誘導的影響差異不顯著，次生胚的數量隨著時間的增加而不斷增加，3種處理對次生胚誘導數量的影響大小為：培養基>培養時間>品種。

3 討論與結論

通過體胚發生途徑建立油棕組織培養技術體系，其初生胚的誘導比較困難，且誘導率也比較低，因此胚的誘導是整個油棕組織培養過程中最關鍵的技術環節，這一現象在其他的棕櫚科植物，如椰子、海棗、檳榔等同樣發生[10-12]。植物外源激素對油棕胚的誘導影響作用很大，二氯苯氧乙酸即2，4-D在油棕胚的誘導中，作用效果明顯。近年來，關于油棕組織培養技術的報道中，2，4-D、毒莠定、麥草畏等植物外源激素都有使用，但2，4-D的使用更加廣譜。本實驗結果表明，2，4-D在初生胚誘導的過程中通用性較好，在3種不同基因型的油棕品系中，胚誘導率圴達到了比較高的水平。但在后續芽誘導的培養實驗中，筆者發現，使用毒莠定的出芽率及芽發育的質量效果會更好。

次生胚誘導和增殖途徑是油棕實現體胚增殖很有效的一種途徑，可以彌補前期油棕初生胚誘導率較低的缺點，實現油棕組培苗數量上的大規模繁育。從本實驗的結果看，在油棕次生胚培養階段，不同基因型即不同油棕品種差異的影響不顯著，如果在前期能夠培養獲得油棕初生胚，后期的次生胚培養可通過比較一致的方法進行增殖培養。同時，基本培養基的組成成分對油棕次生胚的誘導和再生具有顯著的影響。本實驗所選擇的3種基本培養基中，MS是通用性較強的培養基[13]；WPM是針對木本植物培養的基本培養基[14]；Y3培養基的成分比較復雜，常用于椰子等棕櫚植物的組織培養[15]。從誘導效果來看，WPM培養基和Y3培養基的作用明顯優于MS培養基，這表明在無機鹽相對較低的環境下可能比較利于次生胚的誘導；而WPM和Y3培養基比較，前者的組分相對后者簡單，更利于大規模的商業化生產。

參考文獻

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