微波輔助復合酶提取錦燈籠皮果膠的工藝優化

張超 王英臣

摘 要：以吉林地區的錦燈籠皮為原料，利用微波輔助復合酶法對錦燈籠皮中果膠進行工藝優化研究。研究了微波輻射時間、加酶比例（m半纖維素：m纖維素）、復合酶用量（m半纖維素：m纖維素=1：1）、微波功率、料液比、酶解溫度、pH值、酶解時間對果膠提取的影響。采用Box-Behnken Design 響應面優化得到最佳工藝條件為微波輻射時間3.35min、加酶比例1：1.27、復合酶用量（1：1.27）7.78mg、微波功率399.39w。在此條件下驗證果膠得率為9.368%，總半乳糖醛酸為63.02%，通過工藝優化研究可知，實際果膠得率遠小于預測果膠得率。

關鍵詞：錦燈籠皮；果膠；提?。豁憫娣治?；微波；復合酶

中圖分類號：Q539.8 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20160431002

果膠是一種可溶性纖維，具有許多對人體有益的特性，對人體的健康起一定的作用。果膠是制作人類食品和化妝品的天然成分，同時是食品添加劑聯合委員會推薦和公認的安全、天然、新型、功能型食品添加劑。在食品領域中，果膠可以制作果凍，飲料，化妝品等產品。飲食中攝入果膠可促進糞便中脂肪、中性類固醇及膽汁的排泄[1]。

到目前為止，提取果膠的發法有很多，但絕大多數的果膠提取率都很低。酸法提取是目前應用最廣泛的，但是對環境污染比較嚴重。采用酸法提取，果膠提取率低，所以尋求一種環保、高效的提取方法勢在必行。目前已有微波輔助法提取果膠的報道，例如微波提取橘皮果膠工藝研究進展[2]，微波輔助提取西番蓮果皮中的果膠研究等[3]。本實驗采用東北地區的錦燈籠為原料，采用微波輔助復合酶法對錦燈籠皮中果膠的提取進行了優化研究，并采用Box-Behnken Design實驗設計對工藝進行了優化研究，通過本次的研究，獲得了一種環保高效的果膠提取方法，大大的提高了果膠得率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無水乙醇均為分析純；纖維素酶（40U/mg）、半纖維素酶（20U/mg） 上海北諾生物科技有限公司；檸檬酸、檸檬酸三鈉、錦燈籠皮產自東北[4]。

微波化學反應器 MCR-3型鞏義市予華儀器有限責任公司；旋轉蒸發器 RE-300型上海亞榮生化儀器廠；低速離心機 TDL-40B型上海安亭科學儀器廠；精密電子天平 FA 2004型天津天馬恒基儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱 DHG-9035A型上海一恒科技有限公司；水浴鍋DK-S28A型上海精宏有限公司；多功能粉碎機浙江省永康市紅太陽機電有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料制備

稱取100g錦燈籠皮，在沸水中煮10min，除去果皮中色素和殺死果膠當中的酶，冷卻至室溫，放在50℃電熱鼓風干燥箱中烘干。取出干燥的錦燈籠皮置于多功能粉碎機中粉碎，制粉，過60目篩，得錦燈籠皮干粉[5]。

1.2.2 果膠提取

取一定量錦燈籠皮干粉，在一定的pH下，配制成一定料液比溶液，再向其中加入一定量的復合酶與檸檬酸緩沖溶液，置于水浴鍋中在特定的溫度下處理一段時間，取出放在微波化學反應器中，調節微波化學反應器在一定功率下對混合溶液進行微波輻射，處理一段時間后，取出置于90℃水浴鍋中滅酶15min后，開始離心，離心參數為5000r/min，離心3min，重復3次，取上清液，提取液經旋轉蒸發儀濃縮至1/3后，用1.5倍90%乙醇洗出，靜置沉淀30min后進行抽濾，并用80%乙醇洗滌3次，置于50～60℃干燥箱中烘干，得粗果膠成品[6]。

1.2.3 單因素試驗

利用單因素的試驗方法確定最佳的復合酶比例，微波輻射時間，復合酶用量，料液比，pH，酶解溫度，微波功率、酶解時間。固定實驗條件為微波輻射時間為3min、半纖維素酶：纖維素酶=1：1、酶解時間為65min、復合酶用量5mg、料液比1：25、pH4.8、酶解溫度50℃、微波功率400w。分別測定各單因素微波輻射時間（1min、2min、3min、4min、5min）加酶比例（1：3、1：2、1：1、2：1、3：1）、酶解時間（45min、55min、65min、75min、85min）、復合酶用量（2.5mg、5.0mg、7.5mg、10.0mg、12.5mg）、pH（4.4、4.6、4.8、5.0、5.2）、料液比（1：15、1：20、1：25、1：30、1：35）、微波功率（240w、320w、400w、480w、560w）、酶解溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）對錦燈籠皮果膠提取率的影響。

1.2.4 響應面優化

實驗設計采用Design-Expert 8.0.6 軟件[7]在不同單因素實驗基礎上，對錦燈籠皮中果膠的提取進行工藝優化實驗設計見Box-Behnken Design實驗設計表1。

2 結果分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 微波輻射時間對錦燈籠皮中果膠得率的影響

從圖1可以看出，不同的微波輻射時間對錦燈籠皮中果膠提取率影響不同，微波輻射時間的不斷增加提取率不斷增加，當輻射時間為3min時候，提取率最大，之后下降。這種變化情況可能是因為果皮細胞壁被打破，果膠增多，但隨著微波輻射不斷延長，錦燈籠皮中果膠的1，4-糖苷鍵被破壞，果膠結構被破碎成許多小分子果膠，所以錦燈籠皮果膠提取率有所下降。

2.1.2 不同復合酶比例對果膠得率的影響

復合酶比例直接影響了錦燈籠皮中果膠的得率，隨著復合酶比例的不斷增加，錦燈籠皮果膠提取率不斷增加，增加到一定比例后，果膠提取率開始下降。圖2顯示，最適復合酶比例應選擇為1：1。

2.1.3 不同加酶量對果膠得率的影響

在底物濃度一定時，錦燈籠皮果膠提取率隨加酶量的增加而升高，由圖3可知加酶量達到一定程度時果膠提取率明顯減緩，故選擇復合酶量的添加量為7.5mg。

2.1.4 微波功率對錦燈籠皮中果膠得率的影響

微波功率對錦燈籠皮果膠得率的影響，果膠的得率呈現出先升高后下降的趨勢，原因在于微波功率在一定范圍內與酶產生協同作用提高果膠得率，微波功率過大果膠長鏈打斷，小分子果膠增多，果膠得率下降。圖4顯示，最適微波功率應選擇為400w。

2.1.5 不同料液比對果膠得率的影響

錦燈籠皮果膠提取率隨料液比的增加而升高，達到一定料液比時，果膠提取率增加明顯緩慢直至平穩，原因在于底物質量一定時，加入過多的溶液進行調配，果膠提取率變化不明顯，同時為了節約能源，所以由圖5可知，料液比最適為1：30。

2.1.6 不同pH對果膠得率的影響

pH直接影響了果膠的得率，果膠的得率呈現出先升高后下降的趨勢，原因是酶的最適pH一定，隨著pH逐漸增大酶的活性增加，果膠得率增加，pH達到一定時繼續增加，酶的活性降低，果膠得率下降。圖6顯示，最適pH應選擇為4.8。

2.17 酶解溫度對果膠得率的影響

酶解溫度影響了果膠的得率，果膠的得率呈現出先升高后下降的趨勢，原因是溫度升高提高酶的活性，果膠提取率增加，當溫度過高時，酶活力下降，提取率下降。圖7顯示，最適水浴溫度應選擇為50℃。

水浴時間影響了果膠的得率，果膠的得率呈現出先升高后下降的趨勢，原因是酶解時間過長酶活性下降，果膠提取率下降。圖8顯示，最適酶解時間應選擇為75min。

2.2 響應面實驗的結果與分析

2.2.1 Box-Behnken 工藝優化設計結果

實驗設計與結果如表2所示。

2.2.2 回歸方程與方差分析

根據響應面軟件分析得到回歸方程如下：Y=9.31+0.40A-0.17B+0.099C+0.066D+0.013AB+0.043AC+0.078AD-0.015BC+0.055BD-0.040CD-0.85A2-0.31B2-0.33C2-0.11D2

得到如表3所示的響應面回歸模型和方差分析表，由表可知微波輻射時間、復合酶比例、復合酶用量、微波功率對果膠提取率都有極顯著影響，每個決定系數都在可以接受范圍之內，由回歸方程和方差分析表可知，響應面的優化，可以較好地對錦燈籠皮果膠提取率進行預測[8]。經實驗可知微波輻射時間、復合酶比例、復合酶用量、微波功率對果膠提取率影響較大，料液比、pH、酶解時間、酶解溫度影響較小[9]。

各交互因素響應面見表3，由表可知 ：微波輻射時間、復合酶比例、復合酶用量、微波功率對錦燈籠皮果膠提取率影響較明顯，微波輻射時間直接影響果膠得率。

2.3 最佳工藝條件的確定與驗證

利用Design-Expert 8.0.6軟件分析模型方程，獲得最佳工藝條件為微波輻射時間3.35min、復合酶比例1：1.27、復合酶用量（1：1.27）7.78mg、微波功率399.39w，在此工藝條件下模型的預測值為9.368%。由于最佳工藝條件操作起來困難，所以將條件調整為：微波輻射時間3.4min、復合酶比例1：1.2、復合酶用量7.8mg、微波功率400w、料液比1：30、pH4.8、酶解溫度50℃、酶解時間75min，在此條件下，進行平行試驗，得到錦燈籠皮果膠的平均提取率為9.35%，比模型的預測值小，說明在實驗室進行實驗操作，存在一定的環境干擾因素。

2.4 半乳糖醛酸標準曲線繪制

2.4.1 果膠測量方法依據

利用半乳糖醛酸標準品作為對照品，利用分光光度計繪制出標注曲線，測定錦燈籠外皮提取物中果膠含量[10]。

2.4.2 配制半乳糖醛酸標準溶液

稱取0.1000g半乳糖醛酸標準品，加超純水溶解，轉移到100mL容量瓶中，定容。取上述溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL分別加入6個100mL容量瓶中，定容，即得到濃度分別為10ug/mL、20ug/mL、30ug/mL、40ug/mL、50ug/mL、60ug/mL標準溶液[10]。

2.4.3 繪制標準曲線

分別移取6mL濃硫酸與6個比色皿中（2～7號，1號比色皿中加入超純水作為空白對照），分別緩慢加入10ug/mL、20ug/mL、30ug/mL、40ug/mL、50ug/mL、60ug/mL的半乳糖醛酸標準溶液1mL，將所配的半乳糖醛酸標準溶液置于沸水水浴鍋中一段時間后取出，降到室溫加入0.15%咔唑乙醇溶液0.5mL。利用分光光度計在波長為530nm測定吸光值，結果如表4，繪制出標注曲線如圖15，計算得其線性回歸方程為：y=0.0076x+0.0126

2.4.4 測定錦燈籠皮果膠粗產品中半乳糖醛酸的含量

稱取果膠粗產品0.2500g，用50mL無水乙醇充分拌勻，在90℃時恒溫水浴鍋中水浴30min，取出冷卻到室溫，再用抽濾機對所配溶液進行抽濾，將所得物質用無水乙醇洗滌轉移到燒杯當中，加入100mL鹽酸使果膠粗產品進行水解，再將上述溶液轉移至250mL容量瓶中，開始定容，將溶液稀釋20倍，待測。利用分光光度計對所得溶液進行吸光度的測量，測定出特定濃度溶液的吸光度值，利用y=0.0076x+0.0126 R=0.9978計算出錦燈籠

3 結論

實驗表明在標準曲線繪制時，在530nm處吸光度值最大，利用分光光度計測定不同濃度半乳糖醛酸標準品溶液的吸光度值，計算出其線性回歸方程為：y=0.0076x+0.0126，R= 0.9978。

用東北地區所產的錦燈籠提取果膠時，提取率約為9.368%，其中果膠含量約為 63.02%，RSD為5.15%，表明回收率高，結果較準確。

采用微波輔助復合酶法提取錦燈籠果皮中果膠能有效的提高提取率，利用響應面法對工藝條件進行優化，果膠得率進一步提高。

微波輔助復合酶提取錦燈籠皮果膠的工藝優化研究發現了一種高效、環保提取錦燈籠皮果膠的方法，大大提高了果膠得率。

參考文獻

[1]戴少慶，李高陽，唐漢軍等.超聲波輔助復合酶提取椪柑皮果膠的工藝優化[J].食品工業科技，2014，35（11）：193-201.

[2]張闖，單楊.微波提取橘皮果膠工藝研究進展[J].中國食品學報，2013，13（5）：147-153.

[3]黃永春，何仁，馬月飛等.微波輔助提取西番蓮果皮中的果膠的研究[J].食品科學，2007，28（9）：161-164.

[4]陳紅，崔海月，劉秀奇等.微波協同酶法提取玉米皮中的黃色素[J].食品科學，2012，36（6）：50-52.

[5]汪振炯，王仁雷，吳雨龍等.微波協同酶法提取蛹蟲草基質多糖工藝的優化研究[J].食品工業科技，2014，35（11）：188-192.

[6]陳紅，張艷榮，王大為等.微波協同酶法提取玉米須多糖工藝的優化研究[J]食品科學，2010，31（10）：42-46.

[7] Vega-Estrada j，Flores-Cotera L B，Santiago A ，et al.Draw-fill batch culturemode for xylanases by Cellulomonas flavigena on sugar cane bagasse [J].Applied Microbiology and Biotechnology，2002，58（4）：435-438.

[8] Trupkin S ，Levin L，Forchiassin F ，et al.Optimization of a culture medium for ligninolytic enzyme production and synthetic dye decolorization using response surface methodology[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2003，30（12）：682-690.

[9]余先純.響應面優化微波加熱提取橘皮果膠[J].食品研究與開發，2012，33（3）：64-67.

[10]周宏，趙玉英，王冀敏.向日葵桿中果膠提取及含量測定[J].內蒙古民族大學學報，2013，28（1）：28-30.

[11]翁慧，趙玉英，宋娟娟等.超聲法從向日葵盤中提取果膠和果膠含量的測定[J].內蒙古民族大學學報，2010，25（1）：21-23.

[12]蔣平初，金繼波，張錦花.果膠含量的測定[J].化學世界，2007，28（7）：124-127.