擬南芥晚花突變體fve—1和fca—1營養生長時相轉變

劉新慶 郭蕊 范曉寧 王雪 龍鴻

摘 要 擬南芥胚后發育經歷了營養生長和生殖生長兩個主要階段，在營養生長的過程中，由幼齡期向成熟期的轉變稱為營養生長時相轉變。有關這個轉變的基因調控網絡仍不清楚。本文對擬南芥晚花突變體fca-1、fve-1的營養生長時相轉變過程進行了形態學觀察和基因表達分析。結果表明：與野生型相比，fve-1、fca-1植株幼齡期延長，導致營養生長時相轉變延遲。自主開花基因FVE、FCA參與了植物營養生長時相轉變的調控。

關鍵詞 營養生長時相轉變 ；miR156 ；fve-1 ；fca-1 ；擬南芥

中圖分類號 Q754 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.06.010

Vegetative Phase Change in Late-flowering Mutants fve-1 and fca-1

in Arabidopsis thaliana

LIU Xinqing1） GUO Rui1） FAN Xiaoning2） WANGXue1） LONG Hong1）

（1 College of Horticulture and Landscape， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384

2 College of Life Science and Technology， Huazhong Agricultural University，

Wuhan， Hubei 430070）

Abstract Post-embryo development of Arabidopsis thaliana undergoes two main stages， namely， vegetative and reproductive growth phase. The change in vegetative growth from juvenile to adult refers to vegetative phase change. The gene network of regulating vegetative phase change remains unclear. In this paper， morphological observation and gene expression are performed to analyze the vegetative phase change in two late-flowering mutants， namely， fca-1 and fve-1. The results showed that compared with the wild type Ler， both vegetative phase change and blossoming in fca-1 and fve-1 mutants are delayed. And this cause the vegetative phase change delay. Autonomous pathway related gene FVE and FCA of flowering time of Arabidopsis thaliana can regulate the vegetative phase change.

Keywords vegetative phase change ； miR156 ； mutant ； fca-1 ； fve-1 ； Arabidopsis thaliana

高等植物的生命周期主要分為兩個階段，以根莖葉生長發育為標志的營養生長階段和以開花為標志的生殖生長階段[1]。營養生長時期又可分為幼齡期（Juvenile phase）和成熟期（Adult stage），幼齡期不能誘導開花，只有進入成熟期后植物才能經誘導開花[2]，植物由幼齡期向成熟期的轉變稱為營養生長時相轉變（Vegetative phase change， VPC）[3]。植物營養生長時相轉變伴隨的表型變異大多是漸變的。模式植物擬南芥中，幼齡期葉片近圓形，葉緣全緣，葉柄較長；成熟期葉片呈卵圓形，葉緣有鋸齒，葉柄較短。然而，成熟期葉片出現幼齡期所沒有的遠軸面表皮毛，這一表型可以作為判定VPC的形態標志[4-5]。

植物時相轉變是受特定基因調控的。研究表明，一種小分子RNA（miRNA）， miR156及其靶基因SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE（SPL）基因家族參與了植物營養生長時相轉變和開花。miR156促進幼齡期生長而抑制成熟期生長，即抑制VPC發生，其表達水平在幼齡期較高而在成熟期降低，開花后進一步降低；SPL3基因則促進了營養生長時相轉變，并受到miR156的強烈抑制[6]。

開花是植物對環境因素和內源因子的響應結果[7-9]。擬南芥中控制開花的途徑包括：光周期途徑、自主開花途徑、春化途徑和赤霉素途徑[7，10]。自主開花途徑是指植物對外界環境都不敏感，依靠體內各相關基因之間的相互協同和拮抗作用而使植物達到一定生長時期后開花。自主開花途徑的基因如FLOWERING LOCUS VE（FVE）、FLOWERING LOCUS CA（FCA）、LUMINIDE ENDENS（LD）等是通過抑制春化途徑關鍵基因FLOWERING LOCUS C（FLC）的表達來促進開花的[11]。fca-1、fve-1、fpa-1等晚花突變體開花晚于相應野生型[12]，然而這些基因對營養生長時相轉變的影響，尤其是miR156的作用仍不清楚。本研究以擬南芥晚花突變體fca-1、fve-1為材料，通過形態學觀察和基因表達分析，探討擬南芥營養生長時相轉變過程中開花基因FCA、FVE的作用，為研究開花基因與營養生長時相轉變之間的內在機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型擬南芥為Landsberg erecta（Ler）生態型，突變體為Ler背景下的fve-1、fca-1。Ler種子由作物遺傳改良國家重點實驗室須健教授課題組惠贈，fve-1、fca-1購自Arabidopsis Biological Resource Center（ABRC）。

1.2 方法

1.2.1 材料培養

將擬南芥種子置于含濕濾紙的培養皿中，4℃冰箱中春化2～3 d。蛭石與營養土按體積比1∶1混合成培養土，121℃高溫高壓濕熱滅菌后浸濕用于播種。播種后用保鮮膜覆蓋約一周以保濕。培養箱采用人工光照，光強為90 μE/cm2·s，光照時間∶暗培養時間=16 h∶8 h。光照溫度22℃，黑暗溫度20℃，空氣相對濕度約60%。

1.2.2 形態學鑒定

觀察擬南芥野生型Ler，突變體fve-1、fca-1植株，記錄開花時間、蓮座葉數目、產生遠軸面表皮毛的葉片數，蓮座葉葉片的長和寬，計算長寬比值并制作柱狀圖。在體視顯微鏡下，觀察遠軸面表皮毛的產生時間，并進行統計學分析，各個材料樣本數均為20株，重復3次。

1.2.3 RT-PCR

采用Trizol法提取不同天數（每5 d取1次）Ler、fca-1、fve-1植株的總RNA（單個樣本均為多株提取）。采用DNase I消化總RNA中的DNA。利用反轉錄試劑盒（TaKaRa）進行cDNA的合成。引物名稱與序列如下：

ActinF，5′-GCAGACCGTATGAGCAAAGA-3′；

ActinR，5′-AGCAAGGATAGAACCACCAA-3′；

miR156a-F，5′-CTCTCCCTCCCTCTCTTTGATTC-3′；

miR156a-R，5′-AGGCCAAAGAGATCAGCACCGG-3′。

以cDNA為模板進行RT-PCR擴增，以Actin為對照，RT-PCR擴增程序如下：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，58 ℃復性30 s，72℃延伸20 s，共38個循環；72℃延伸10 min，-20℃保存。每個樣品重復3次。

使用0.5×TBE溶液配制1%瓊脂糖凝膠，取10 μL PCR產物點樣，電泳檢測目的條帶，觀測反轉錄效果并觀察基因表達的趨勢。

2 結果與分析

2.1 突變體fve-1、fca-1的總蓮座葉數比野生型明顯增多

fve-1、fca-1突變體和野生型的發育形態觀察結果顯示，fve-1、fca-1突變體植株的總蓮座葉數及葉片特征等方面出現與野生型明顯不同的異常表型。生長35 d時Ler植株已開花結果，而fve-1、fca-1植株尚未出現花序（圖1A），說明fve-1、fca-1突變體比野生型發育遲滯，開花晚。fve-1、fca-1植株的葉片比野生型增大（圖1A），Ler、fve-1、fca-1總蓮座葉數分別為7、21、17，突變體比野生型明顯增多，其中fve-1的總蓮座葉數最多（圖1B）。葉片增大、增多的結果表明，fve-1、fca-1突變體植株發育遲滯。

2.2 fve-1、fca-1突變體植株葉片特征顯示其營養生長時相轉變延遲

在擬南芥營養生長時相轉變中，葉形是漸變的特征，幼齡期近圓形，成熟期呈卵圓形；而成熟期葉片會出現幼齡期所沒有的遠軸面表皮毛。形態觀察顯示，Ler植株的遠軸面表皮毛在14 d出現，而fve-1、fca-1則分別在19、18 d出現（圖2）。兩個突變體植株葉片遠軸面表皮毛的出現較Ler晚，說明fve-1、fca-1植株幼齡期延長，營養生長時相轉變延遲。Ler植株生長約20 d出現可見花芽，而fve-1在40 d時才出現花序，fca-1約在38 d出現花序（圖2）。

葉形觀察表明，野生型Ler的子葉和第1、2片蓮座葉近圓形，葉片長寬比約為1，后期的葉片稍呈卵圓形，開始生長遠軸面表皮毛的第4片葉與之前的蓮座葉相比變化明顯，葉片長寬比大于1.5；fve-1、fca-1突變體第一對真葉長寬比均約為1，葉片近似為圓形。隨后葉形由圓形逐漸變成橢圓形，長寬比逐漸增大。fve-1和fca-1植株葉片長寬比分別在開始生長遠軸面表皮毛的第6和第7片葉時達到1.5（圖3）。這些結果說明，fve-1、fca-1植株營養生長時相轉變延遲。

2.3 fve-1、fca-1營養生長時期miR156表達量變化

鑒于miR156參與了擬南芥營養生長時相轉變，本研究檢測了fve-1、fca-1突變體各發育時期其表達量的變化。RT-PCR結果表明，Ler野生型在生長10 d時，miR156a的表達量為最高，在15 d時開始降低，20 d時明顯降低，25 d時RT-PCR條帶基本看不到；fca-1和fve-1突變體生長10 d時，miR156a的表達量為最高，fca-1在15 d時也開始降低，在20～25 d時明顯降低，30 d時RT-PCR條帶基本消失，而fve-1中miR156的表達量下降更緩慢，在20 d時開始降低，25 d時明顯降低，35 d時條帶基本消失。野生型和突變體在發育早期中miR156a的表達量均很高，野生型在15 d時miR156a的表達量有所下降，在15～20 d時下降明顯，說明發生營養生長時相轉變；此時，fve-1突變體中miR156a的表達量仍較高，fve-1和fca-1的miR156a表達量均在20～25 d時下降較明顯，說明晚于野生型發生營養生長時相轉變（圖4）。

3 討論

擬南芥器官形態的變化貫穿于全部植物發育的過程中，這種變化與植物頂端分生組織的發生和分化相關，并受特定基因的表達調控[13-14]。營養生長階段時相轉變是與生殖能力相關的[15]，然而控制開花的基因是否參與營養生長時相轉變仍不清楚。本研究結果表明，擬南芥的自主開花基因FVE、FCA參與了營養生長時相轉變的調控。突變體fve-1、fca-1的總蓮座葉數比野生型明顯增多，發育進程延遲。這與我們前期利用多葉突變體amp1-1為材料的遺傳分析結論相似，多葉突變體amp1-1發育進程延遲[16]。在長日照條件下，突變體fve-1、fca-1葉片遠軸面表皮毛出現的時間（分別為19和18 d）比野生型Ler（14 d）晚，說明Ler從14 d進入營養生長的成熟期，而fve-1、fca-1則分別是在19、18 d，fve-1、fca-1植株幼齡期明顯增長，從而導致成熟期也相應的推遲。葉形和葉片長寬比的實驗結果也支持以上結論。Ler、fve-1、fca-1分別在20、40、38 d產生花序，進入生殖生長階段，突變體fve-1、fca-1進入生殖生長時期也明顯晚于野生型。

植物生長發育時相轉變的基因調控網絡尚不清楚。研究表明，小RNA及其靶基因參與了調控植物營養生長時相轉變的過程[11]。microRNA（miRNA）為內源性的非編碼小RNA，它們可與靶mRNA的3'非編碼區結合，從而降解靶基因的mRNA或抑制轉錄物的蛋白翻譯，進而調控有機體生長、分化、發育[17]。近年來，已經越來越清楚的是，幼齡期到成熟期時相轉變及生殖生長時相轉變共享一些主要的調控因子，特別是，兩個進化上高度保守的小RNA，miR156和miR172，以及它們的靶標，是植物生長時相轉變遺傳調控機制的關鍵組分[6，16，18]。miR156靶定SPL轉錄因子家族，調控幼齡期到成熟期及開花的轉變。相反，miR172靶定2個APETALA2（AP2）的DNA結合結構域編碼蛋白的mRNA，與miR156相互拮抗調控幼齡期到成熟期及開花的轉變[15，19-20]。miR156在幼齡期高表達，而在成熟期則下降；組成型超表達miR156延長了幼齡期的性狀，而miR156活性喪失則這些性狀消除，說明miR156是幼齡期發育的充分必要條件[15]。本研究表明，無論是野生型還是突變體，當擬南芥處于幼齡期時，miR156表達量均很高，伴隨著植物發育的進程，miR156表達量逐漸下降，從miR156下調表達量分析，fve-1和fca-1突變體比Ler野生型進入成熟期延遲，這個結果與形態學觀察的結果相一致。進入生殖生長時期，miR156表達量進一步降低，fve-1和fca-1中miR156表達量比野生型的下降緩慢。這樣，fve-1和fca-1晚花突變體在延遲開花的同時，它們的營養生長階段也被延長。自主開花基因FVE、FCA對幼齡期和成熟期的植株有促進其生長發育的作用，可以縮短這兩個時期生長發育的時間，從而對植物的生長發育過程進行調節，這些基因突變后營養生長時相轉變延遲，植株晚花。

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