生物樣品中阿霉素的分析方法優化研究

劉匡一　彭秘　李晗蕓　劉亞麗　蘇丹

摘 要 目的：運用高效液相質譜聯用（LC-MS）技術對阿霉素體內血漿分析方法進行優化，為更好地對藥物進行體內血漿藥物定量分析奠定基礎。 方法：液相方面，考察不同的色譜柱，從中選擇響應好的作為分析的色譜柱，同時，以高響應為前提，選擇合適流動相和梯度條件；對于質譜，選擇母離子和子離子，優化碰撞電壓、毛細管電壓等參數；進樣前，對血漿樣品的前處理中提取條件方面進行優化，篩選出合適的萃取有機溶劑并選擇合適的內標。結果：該方法快速、靈敏、有效，適合阿霉素的體內血漿藥物定量分析。

關鍵詞 阿霉素 分析方法 生物樣品

中圖分類號：R914.2 文獻標識碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdkx.2016.02.068

Abstract Objective： LC-MS （high performance liquid chromatography mass spectrometry） method was used to optimize the plasma analysis method in vivo， and to lay the foundation for the quantitative analysis of drugs in vivo. Methods： In Liquid phase. The effects of different chromatographic column， the selection response as a chromatographic column. At the same time， with high response as the premise， select the appropriate mobile phase and gradient conditions； parameters for mass spectrometry， select the parent ion and ion， optimization of impact voltage and capillary voltage is needed； sampling of the extraction conditions were optimized and screened a suitable organic solvent extraction and choose the appropriate internal standard. Results： This method is fast， sensitive and effective， and is suitable for the quantitative analysis of Adriamycin in vivo.

Key words adriamycin； analysis method； biological samples

阿霉素，又稱多柔比星，可抑制RNA 和DNA的合成，對RNA的抑制作用最強，①抗瘤譜較廣，對多種腫瘤均有作用，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用。是臨床常用的蒽環類抗惡性腫瘤的藥物，可廣泛用于肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等的化療。②

高效液相色譜-質譜聯用技術（high-performanceliq id chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）是以高效液相色譜為分離手段，以質譜為鑒定工具的一種分離分析技術。它將高效液相色譜對復雜樣品的高分離能力與質譜具有的高選擇性、高靈敏度以及能夠提供分子量與結構信息的優點結合起來，在中藥研究中得到廣泛應用。③④質譜是強有力的結構解析工具，能為結構定性提供較多的信息，是理想的色譜檢測器，不僅特異，而且具有極高的檢測靈敏度。⑤串聯質譜（MS /MS）在單極質譜給出化合物相對分子量的信息后，對準分子離子進行多極裂解，進而獲得豐富的化合物碎片信息，確認目標化合物，對目標化合物定量等。⑥本文通過多反應監測（MRM）數據采集方式對阿霉素母離子和子離子進行掃描確認，優化質譜參數，為血漿樣品的分析奠定基礎。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

LC-MS ：安捷倫的1290 Infinity快速液相色譜 安捷倫6460三重四極桿MS / MS；HC-3018R高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司），KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； BF-200 氮氣吹干儀（北京優晟聯合科技有限公司）。

1.2 試劑

阿霉素鹽酸鹽（批號246-818-3）為標準品，購自Sigma公司；長春新堿（批號3924631）為標準品和內標物，購自Sigma公司；甲酸為色譜純，購自Sigma-Aldrich公司；乙腈為色譜純，購自Fisher Scientific公司；丙酮為分析純，購自廣東省精細化學品工程技術研究開發中心；乙醚為分析純，購自上海實驗試劑有限公司；二氯甲烷為分析純，購自天津市福晨化學試劑廠；異丙醇為色譜純，購自Fisher Scientific公司。

2 色譜條件優化

2.1 色譜柱的篩選

本研究對3個不同廠家不同型號的4根色譜柱（Phenomenex L na C18 4 m 50？.1mm；Waters C18 1.7 m 50？.1mm；Angilent Proshe C18 2.7 m 75？.1mm；Waters XSELECTTM CSHTM C18 5 m 50？.6mm）進行了測試。

2.2 流動相梯度條件的選擇

合適的流動相及梯度條件時保證分析測定準確性和穩定性的前提，本實驗分別考察水相，有機相及梯度對生物樣品中阿霉素測定的影響。

2.3 血漿樣品的前處理

考察沉淀蛋白法和液-液萃取法兩種類型的樣品前處理方法。對于萃取溶劑考察了二氯甲烷與異丙醇（4：1）、二氯甲烷、丙酮、乙醚。

在沉淀蛋白法中，取100 L空白血漿，加入高，中，低三種不同濃度的阿霉素（0.025 g/ml、0.5 g/ml、1 g/ml），同時加入內標與乙腈， 振蕩渦旋（3min），離心（16000rpm，10min），取上清200 L進樣，每個不同的濃度各平行三份。

對于液-液萃取法，取100 l空白血漿，加入高，中，低三種不同濃度（同上）的阿霉素，同時分別加入內標與萃取溶劑（二氯甲烷與異丙醇（4：1）、二氯甲烷、丙酮、乙醚）， 振蕩渦旋（3min），離心（16000rpm，10min），取上清200 L，進樣，每個不同的濃度各平行三份。

2.4 內標物的選擇

為了以后更好地定量分析體內血漿藥物濃度，選擇恰當的內標，該內標應不影響藥物的結構，不與藥物發生反應，出峰時間應與藥物有明顯的區別。

3 質譜條件的優化

本研究對血漿中阿霉素數據的采集采用MRM方式，考察了阿霉素的母離子與子離子，并優化了進樣條件下質譜的毛細管電壓與碰撞氣能。

4 結果

4.1 色譜柱選擇

實驗結果表明，Waters XSELECTTM CSHTM C18（5 m 50 ？4.6mm）柱最適合進行分離，所獲得的色譜峰最佳，保留時間合適，且顯著避免了峰的拖尾。典型色譜圖如圖1。

4.2 流動相選擇

4.2.1 水相及其pH 值對色譜行為的影響

流動相pH 值對樣品的分離有較大影響，調低pH 值后，便得到尖銳的峰型。向流動相中加入少量甲酸，可以使待測組分的離子化程度增加，質譜信號強度增大；而且，流動相酸性的增加，可以減少由于待測物分子結構中堿性胺基側鏈與硅膠柱中未完全硅烷化的硅醇基相互作用所導致的色譜峰拖尾和峰展寬現象，使化合物快速被洗脫，從而縮短了每次的分析時間，實現了生物樣品分析所要求的靈敏、快速和高通量測定。

4.2.2 流動相梯度條件的選擇

為了使所檢測的色譜峰分離度好，出峰時間合理，采用梯度洗脫方法。阿霉素極性相對較小，適宜在乙腈比例較大的系統中分離，為了保證待測物與內標較好的峰型和適合的保留時間，同時避免內源性物質的干擾，本實驗進行了不同梯度比例的優化，最終確定 0 min 到2.5min 范圍內，水相比例由75%到10%，再回到75%，色譜柱平衡2.5min。在此梯度條件下阿霉素與內標可同時測定，峰型較好，符合測定要求同時又節了省分析時間。

4.3 提取條件選擇

通過對各萃取溶劑所得峰形與提取效率的比較，最終選擇萃取劑為二氯甲烷：異丙醇（4：1）。各溶劑的提取效率見表1。

表1 各提取溶劑下阿霉素的峰面積響應值

4.4 內標物的選擇

理想的內標應該與待測組分理化性質比較接近，在待測物的色譜條件、樣品處理過程中都能保持與待測物的一致性。在提取的過程中，內標應該能追蹤待測組分，以補償待測組分提取回收率改變所發生的變化。根據以上內標選擇原則，本實驗中的內標物，選擇了與阿霉素相似，具有一分子伯胺基的長春新堿，其提取條件、衍生過程及衍生物的色譜保留行為均與阿霉素十分相近，從而有效保證了定量分析方法的精密與準確。

4.5 質譜條件優化

本研究采用的離子源為ESI，正離子模式，數據采集采用MRM 方式。阿霉素和內標的分子結構中均含有堿性基團，經考察后發現正離子方式檢測相對于負離子方式檢測能夠得到更好的質譜響應，因此選用了正離子方式檢測。

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（1）母離子和子離子的選擇。阿霉素分子結構中因為含有一個氨基，氨基易得一氫離子生成氨根正離子，所以母離子為（m/z 544.2）在選擇阿霉素離子時，由于碳雜鍵容易斷裂，斷裂生成的離子（m/z 360.9）穩定且信號強。

（2）毛細管電壓的選擇。在試驗過程中發現阿霉素對照品在毛細管電壓大小約125v 時的電離效果較好，電壓減小會影響化合物的電離效果，降低響應信號。

（3）碰撞氣能的選擇。碰撞氣是母離子裂解產生子離子的一個重要條件，當碰撞氣流速大小設定在30v 時，信號響應比較穩定。

5 討論

本實驗完成了對血漿中阿霉素分析方法優化的研究，確定了Waters XSELECTTM CSHTM C18（5 m 50？.6mm）色譜柱，內標長春新堿、合適的濃度梯度和準確的質譜參數，在選擇提取溶劑方面，篩選了四種有機溶劑，確定了萃取劑為二氯甲烷：異丙醇 4：1的溶液，并再一次在此基礎上優化生物樣品復溶方法，使色譜峰的峰型更好，響應更高。通過以上實驗，最終確定了最優的色譜，質譜條件，解決了峰展寬和拖尾的問題，并能夠滿足快速、靈敏、高通量的阿霉素血漿生物樣品分析測試要求。

通訊作者：劉亞麗，蘇丹

注釋

① Cutts S M， Phillips D R. Use of oligonucletides to define the site of interstand cross-links induced by Adriamycin[J]. Nucleic acids research，1995.23（13）：2450-2456.

② Young R C， Ozols R F， Myers C E. The anthracycline antineoplastic drugs[J].New England Journal of Medicine，1981.305（3）：139-153.

③ 劉麗芳.藥品標準中 HPLC 法色譜條件的優化與系統適用性試驗的重要性[J].中國藥品標準，2005.6（1）：3-6.，

④ 邵清松，胡潤淮.高效液相色譜-質譜聯用技術在中藥研究中的應用[J].中醫藥學報，2007.35（3）：44-47.

⑤ 龐煥，文允鎰.質譜聯用技術研究進展及其在藥物分析中的最新應用[J].中國藥學雜志，2004.36（7）：433-435.

⑥ 李忠紅，王玉，倪坤儀.LCMSn在藥物分析中的應用[J].藥物分析雜志，2004.24（3）：341-344.