大鼠腦缺血損傷后髓過(guò)氧化物酶的活性變化以及蒙藥嘎日迪-13的干預(yù)作用

曹麗霞 何靜波 鄭延澤 張浩楠 田彩云 武海軍 楊玉梅

(包頭醫(yī)學(xué)院心血管研究室， 內(nèi)蒙古 包頭 014040)

實(shí)驗(yàn)研究

大鼠腦缺血損傷后髓過(guò)氧化物酶的活性變化以及蒙藥嘎日迪-13的干預(yù)作用

曹麗霞 何靜波 鄭延澤 張浩楠 田彩云 武海軍 楊玉梅*

(包頭醫(yī)學(xué)院心血管研究室， 內(nèi)蒙古 包頭 014040)

目的：探討腦缺血損傷后不同時(shí)相腦組織和血清中髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的活性變化以及蒙藥嘎日迪-13對(duì)其的影響。方法:取雄性SD大鼠360只，將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血模型組、嘎日迪-13大劑量組、嘎日迪-13中劑量組、嘎日迪-13小劑量5個(gè)組，每組又隨機(jī)分為缺血1 h組、6 h組、12 h組、24 h組、72 h組與120 h組6個(gè)時(shí)相組，嘎日迪-13 大、中、小給藥組分別以1.2 g/100mL、0.6 g/100mL和0.3 g/100mL濃度2mL/100g灌胃，1次/d，連續(xù)27d后，采用改良Zea Longa線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型，進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，在各時(shí)相規(guī)定時(shí)間點(diǎn)麻醉大鼠后從腹主動(dòng)脈采血并取腦組織，采用分光光度法檢測(cè)MPO活性。結(jié)果:與假手術(shù)組比較，腦缺血模型組各時(shí)相腦組織和血清中MPO活性都明顯升高(P< 0. 05)，具有顯著性差異；與腦缺血模型組比較，嘎日迪-13大、中、小劑量組各時(shí)相腦組織和血清中MPO活性都明顯降低，與模型組比較具有顯著性差異(P<0. 05)，且24h時(shí)作用尤為明顯(P<0. 01)。結(jié)論:嘎日迪-13可能是通過(guò)減少腦缺血損傷后各時(shí)相MPO活性，調(diào)節(jié)各時(shí)相炎癥因子相互之間的作用，減輕腦組織損傷，從而發(fā)揮對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用。

嘎日迪-13；腦缺血；MPO

近年來(lái)，腦缺血損傷的研究中主要集中在缺血后的炎癥反應(yīng)過(guò)程。炎癥反應(yīng)在腦缺血損傷后的病程的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后扮演了非常重要的角色。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，炎癥反應(yīng)介導(dǎo)了腦組織缺血缺氧損傷，其中白細(xì)胞特別是中性粒細(xì)胞的聚集、浸潤(rùn)是炎癥反應(yīng)發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase, MPO) 活性作為評(píng)價(jià)中性粒細(xì)胞組織浸潤(rùn)程度的重要指標(biāo)之一，在近些年來(lái)的研究中頗受關(guān)注。利用其可以使過(guò)氧化氫還原這一特性不僅可以評(píng)價(jià)酶的活力，而且可定量測(cè)定中性粒細(xì)胞的數(shù)目，從而反映中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎癥損傷程度。本研究室前期已從宏觀、功能、生理、生化等多方面證明[1-2]蒙藥嘎日迪-13對(duì)缺血性腦損傷具有明顯的保護(hù)作用。本文采用分光光度法觀察了嘎日迪-13對(duì)大鼠腦缺血損傷后不同時(shí)相腦組織和血清中髓過(guò)氧化物酶的活性變化，來(lái)進(jìn)一步探討嘎日迪-13對(duì)缺血性腦損傷保護(hù)的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物：清潔級(jí)SD大鼠(體重150～250 g)，雄性，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，許可證編號(hào)SCXK(京)2011-0012。

1.2 藥物與試劑：嘎日迪-13，內(nèi)蒙古奧特奇蒙藥股份有限公司(金山)蒙藥廠，批號(hào)：080905； MPO試劑盒，南京建成生物科技有限公司，批號(hào)：A044。

1.3 主要儀器: UV765紫外分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-16G高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)技術(shù)儀器廠；IYZKM電子恒溫水浴鍋，北京市光明醫(yī)療儀器廠。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥：SD大鼠，雄性，360只。隨機(jī)分為5個(gè)大組，即假手術(shù)組(Sham)、模型組(Model)、嘎日迪-13大劑量組(Garidi L)、嘎日迪-13中劑量組(Garidi M)和嘎日迪-13小劑量組(Garidi S)；每個(gè)大組又分為6個(gè)小組，分別為1 h、6 h、12 h、24 h、72 h和120 h組，每組12只大鼠。嘎日迪-13大、中、小劑量組分別以2 mL/100g灌胃給藥，給藥劑量分別是0.24 g/kg、0.12 g/kg和0.06 g/kg；假手術(shù)組和模型組分別給予等容量生理鹽水。各組連續(xù)灌胃27 d，1次/d，末次給藥1h后制備模型，造模后不再進(jìn)行給藥干預(yù)。

2.2 局灶性腦缺血模型的建立：采用線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞方法制備局灶性永久型大鼠腦缺血模型。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉0.1 mL/100 g麻醉后，取仰臥位固定并用碘伏消毒，在頸正中做切口，分離暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。結(jié)扎CCA、ECA近心端，于靠近ICA與ECA分叉處剪一V形小口，從CCA向ICA緩慢插入栓線，結(jié)扎ICA固定栓線，逐層關(guān)閉肌肉縫合皮膚。假手術(shù)組僅分離和結(jié)扎左側(cè)CCA、ECA和ICA，不插入栓線。各組大鼠造模2h后采用Zea Longa[3]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能的評(píng)分，以出現(xiàn)Homer征(即同側(cè)眼球下陷，瞼裂變小，瞳孔縮小)以及1<評(píng)分<4分者為模型成功，其他剔除。

2.3 腦組織及血清中MPO活性的測(cè)定：在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)，麻醉大鼠后腹主動(dòng)脈取血，室溫放置2小時(shí)，離心取上層血清；斷頭取缺血側(cè)腦組織，制備腦勻漿。采用MPO試劑盒測(cè)定腦組織和血清中MPO的活性水平。

3 結(jié)果

3.1 嘎日迪-13對(duì)神經(jīng)功能評(píng)分的影響：神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，而腦缺血模型組各時(shí)相神經(jīng)功能評(píng)分較假手術(shù)組顯著升高(P<0.01)，表明大鼠腦缺血模型制作成功；嘎日迪-13各劑量組神經(jīng)功能評(píng)分較同時(shí)相模型組比較顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 嘎日迪-13對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響

與假手術(shù)組比較**P<0.01，與模型組比較##P<0.01

3.2 嘎日迪-13對(duì)不同時(shí)相腦組織和血清中MPO活性的影響

3.2.1 嘎日迪-13對(duì)不同時(shí)相腦組織中MPO活性的影響：與假手術(shù)組比較，各時(shí)相腦缺血模型組大鼠腦組織中MPO活性明顯升高，24 h達(dá)到高峰，72 h后有所下降，但仍高于假手術(shù)組(P< 0. 05)；與腦缺血模型組比較，各時(shí)相嘎日迪-13大、中、小劑量組大鼠腦組織中MPO活性明顯降低(P<0. 05)，但增長(zhǎng)趨勢(shì)和模型組相同，在24 h達(dá)到高峰，72 h后有所下降。見(jiàn)表2。

表2 嘎日迪-13在不同時(shí)相對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織中MPO活性的影響

與假手術(shù)組比較*P<0.05，與模型組比較#P<0.05

3.2.2 嘎日迪-13對(duì)不同時(shí)相血清中MPO活性的影響：各時(shí)相腦缺血模型組與假手術(shù)組比較，大鼠血清中MPO活性明顯升高，于24 h達(dá)到高峰，72 h后有所下降，但仍高于假手術(shù)組(P< 0. 05)；嘎日迪-13大、中、小劑量組大鼠血清中MPO活性較同時(shí)相模型組比較顯著降低(P<0. 05)，但增長(zhǎng)趨勢(shì)和模型組相同，在24 h達(dá)到高峰，72 h后有所下降。見(jiàn)表3。

表3 嘎日迪-13在不同時(shí)相對(duì)局灶性腦缺血大鼠血清中MPO活性的影響

與假手術(shù)組比較*P<0.05，與模型組比較#P<0.05

4 討論

腦組織缺血缺氧后會(huì)引發(fā)一系列的病理改變，其中有關(guān)中性粒細(xì)胞所引發(fā)的炎癥反應(yīng)過(guò)程在近些年來(lái)的研究中備受關(guān)注。研究表明，炎癥反應(yīng)是造成缺血后腦損傷的主要原因之一。腦組織缺血早期的炎癥反應(yīng)會(huì)加重神經(jīng)細(xì)胞的損害作用，而晚期炎癥反應(yīng)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的再生和恢復(fù)有益[4-5]。中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和活化又是介導(dǎo)腦缺血炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)。當(dāng)中性粒細(xì)胞在缺血腦組織中黏附、積聚、浸潤(rùn)，從而釋放大量的炎癥介質(zhì)，是導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷的主要原因[6]；通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞的黏附和浸潤(rùn)或使用藥物來(lái)減少中性粒細(xì)胞的總數(shù)能夠減輕缺血性腦損傷[7-8]。MPO是由中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和某些組織的巨噬細(xì)胞嗜天青顆粒分泌的一種重要的過(guò)氧化物酶，它可以特異性標(biāo)記和激活中性粒細(xì)胞[9]。因此，MPO水平及活性變化是評(píng)價(jià)中性粒細(xì)胞在組織中浸潤(rùn)程度的重要觀測(cè)指標(biāo)[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織和血清中MPO活性較假手術(shù)組明顯升高，提示MPO參與了腦缺血后神經(jīng)病理?yè)p傷，并且在腦缺血后1h開(kāi)始表達(dá)，24h達(dá)到高峰，隨后表達(dá)開(kāi)始降低，這與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，嘎日迪-13給藥組可顯著降低大鼠腦組織和血清中MPO活性，在腦缺血后24h作用最明顯，提示嘎日迪-13對(duì)腦缺血損傷具有保護(hù)作用，且大劑量嘎日迪-13的保護(hù)效果更為顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，嘎日迪-13可顯著降低模型組大鼠腦組織和血清中MPO活性，改善腦缺血后腦組織和血清中中性粒細(xì)胞在缺血區(qū)的聚集、黏附和浸潤(rùn)，從而減輕腦缺血后的炎癥反應(yīng)發(fā)揮對(duì)腦缺血損傷的治療作用。

腦缺血后中性粒細(xì)胞在體內(nèi)存在著復(fù)雜的相互關(guān)系，它們之間通過(guò)合成和分泌的相互調(diào)節(jié)。由此可推測(cè)，嘎日迪-13可能是通過(guò)調(diào)節(jié)MPO活性的表達(dá)、合成和分泌以及相互之間的誘導(dǎo)或抑制作用，從而起到抑制中性粒細(xì)胞在缺血區(qū)的聚集、黏附和浸潤(rùn)，從而減少缺血區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的進(jìn)一步壞死和凋亡，降低腦梗死體積。

[1]武海軍,楊玉梅,何靜波，等.扎沖十三味及其有效組分揮發(fā)油對(duì)大鼠腦缺血的保護(hù)作用[J].中藥藥理與臨床,2012,28(5):190-192.

[2]田彩云,張浩楠,武海軍,等.嘎日迪-13對(duì)局灶性腦缺血大鼠 NSE、TNF-α、IL-6 表達(dá)的影響[J].中草藥,2015,46(5):716-720.

[3]Zea Longa EL, Weinstein RP, Carlon S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[4]Williams AJ, Dave JR, Tortella FC. Neuroprotection with the proteasome inhibitor MLN519 in focal ischemic brain injury: relation to nuclear factor kappaB (NF-kappaB), inflammatory gene expression, and leukocyte infiltration[J].Neurochem Int, 2006, 49(2):106-112．

[5]Stanimirovic D, Satoh K. Inflammatory of cerebral endothelium: a role in ischemic brain inflammation[J].Brain Pathol,2000,10(1):113-126.

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[7]王知秋,陳銜城,楊國(guó)源.小鼠局灶性腦缺血后ICAM-1、Mac-1和MPO活性的變化[J].復(fù)旦學(xué)報(bào), 2003, 30(4):304-307.

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[11]張國(guó)紅,王春霖,呂平. 大鼠局灶性腦缺血再灌注后不同時(shí)間E-選擇素、P-選擇素和細(xì)胞間粘附分子-1的表達(dá)[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2005, 21(10):1218-1223.

2016年9月27日收稿

Changes of myeloperoxidase after Cerebral Ischemia in Rats and Intervention of Mongolian Medicine Garidi-13

CAO Li-xia, HE Jing-bo, ZHENG Yan-ze, ZHANG Hao-nan, TIAN Cai-yun, WU Hai-jun, YANG Yu-mei

Institute of Cardiovascular, Bao Tou Medical Collage, Bao Tou 014040,China

Objective: To investigate the activity of myeloperoxidase (MPO) in brain tissue and serum at different phase after cerebral ischemic in rats as well as the effect of Mongolian Medicine Gridi-13 on them. Methods: A total of 360 male SD rats were selected. They were randomLy divided into sham-operated group, model group, Gridi-13 large dose group, Gridi-13 middle dose group and Gridi-13 small dose group. Each group was randomLy divided into 1 h, 6 h, 12 h, 24 h, 72 h and 120 h time phase group. The middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was established by modified Zea Longa thread-occlusion method and the activity of MPO in brain tissue and serum were analyzed by spectrophotometry. Results: Compared with the sham group, model group the activity of MPO in brain tissue and serum at different phase was significantly increased (P<0. 05), has significant differences. Garidi-13 in each dose group could predominantly reduce the activity of MPO in brain tissue and serum at different phase, compared with model group has significant difference (P<0. 05). And the role of 24h is particularly evident (P<0.01). Conclusion: Gridi-13 could predominantly reduce the activity of MPO protect cerebral ischemia injury in rats, which may be related with alleviating neuronal damage, regulating inflammatory factors and relieving the injury of brain tissue to play a role of therapeutic action in cerebral ischemic injury.

Gridi-13; cerebral ischemic; MPO

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目，編號(hào)81160560

曹麗霞(1990-)，女，碩士在讀，研究方向?yàn)橹忻伤幩幚砼c心血管藥理。Tel:18747274656 E-mail: 1550074087@qq.com

*通訊作者： 楊玉梅，女，教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail: yym457@yahoo.com.cn

R291.2

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1006-6810(2016)12-0029-04