倒置熒光顯微鏡在醫學研究生實驗教學中的使用與管理

莫倩珍　劉靜

摘要：科學研究的需要，使得倒置熒光顯微鏡在醫學科研型研究生實驗教學中的使用越來越普遍，因此正確使用和妥善管理顯得尤為重要。本文從使用與管理角度加以討論，總結了使倒置熒光顯微鏡更好地為實驗教學服務的方法。

關鍵詞：倒置熒光顯微鏡；實驗教學；正確使用；妥善管理

中圖分類號：G647 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2016）16-0261-02

倒置熒光顯微鏡是近代發展起來的新式熒光顯微鏡，其由倒置顯微鏡和落射熒光裝置組成，具有在培養皿或培養瓶內進行顯微觀察的特點，可實現活體細胞和組織、流質、沉淀物等的相差、熒光觀察是科學研究工作中的理想儀器。所以，在醫學科研型研究生的實驗教學中，掌握倒置熒光顯微鏡的使用至關重要，只有正確的使用和妥善的管理倒置熒光顯微鏡，才能發揮它的功能和提高使用率，使之更好地為實驗教學和科學研究服務。

一、倒置熒光顯微鏡的正確使用

倒置熒光顯微鏡是用于高端生物科學研究領域的多功能顯微鏡，其結構復雜且價格昂貴，因此，要想醫學研究生正確掌握倒置熒光顯微鏡的操作使用規范，教師得首先在示范倒置熒光顯微鏡的實際操作之前，開設學習倒置熒光顯微鏡基本知識的課程，介紹倒置熒光顯微鏡的結構、原理、功能和基本使用方法，再在具體的使用操作中，針對不同的標本，示范不同的功能，由淺入深，逐漸使醫學研究生對倒置熒光顯微鏡的操作使用規范化。

1.明視野觀察的正確使用。倒置熒光顯微鏡的功能之一是明視野觀察，其基本原理是標本經光線照射后，各部分對光吸收的不同而在明亮的背景中實現成像，主要適用于經染色或本身具有顏色的細胞、組織切片等標本的觀察。其基本步驟為：①打開外置白光電源供電器開關和倒置熒光顯微鏡左側的白色按鈕開關；②通過倒置熒光顯微鏡的左側光強調節旋鈕，調整到合適的照明亮度；③確認照明支柱上方的NCB11、ND、D濾光片推進光路；④旋轉倒置熒光顯微鏡右側的旋鈕，使光路處于“EYE”位置；⑤調節目鏡筒瞳距和屈光度；⑥旋轉聚光鏡轉盤，將“A”檔移入光路；⑦放置切片標本，通過旋轉對焦手輪對標本進行聚焦；⑧用所需的放大倍數物鏡觀察標本。明視野觀察是所有顯微鏡具備的功能，普通應用于科學研究中。醫學研究生由于本科畢業于不同的院校，文化背景參差不齊，對顯微鏡的掌握程度不同，因此教師在實驗教學過程中很有必要再次向他們灌輸良好的使用習慣。另外，還要向他們講解常見問題出現時應采取的策施。例如，接通電源開關而燈不亮時，可檢查亮度控制按鈕是否打開、電源線是否接觸良好、燈泡是否燒壞；視場圖像模糊時，可通過逐步移動物鏡、目鏡和載玻片來尋找原因；旋轉亮度調節旋鈕而亮度無變化時，可檢查控制線是否正確連接。

2.相差觀察的正確使用。倒置熒光顯微鏡的功能之二是相差觀察，其基本原理是將樣本不同部分的光程差轉變為振幅差，經過帶有相位片的相差物鏡和帶有環狀光闌的聚光鏡實現觀測，主要適用于活細胞或不染色的組織切片觀察。其基本步驟為：①打開外置白光電源供電器開關和倒置熒光顯微鏡左側的白色按鈕開關；②通過倒置熒光顯微鏡的左側光強調節旋鈕，調整到合適的照明亮度；③確認照明支柱上方的NCB11、ND、D濾光片推進光路；④旋轉倒置熒光顯微鏡右側的旋鈕，使光路處于“EYE”位置；⑤調節目鏡筒瞳距和屈光度；⑥旋轉聚光鏡轉盤，將合適的相差環轉入光路（4X對應PHL，10X/20X對應PH1，40X對應PH2）；⑦放置細胞標本，通過粗微調機構對標本對焦；⑧用所需的放大倍數物鏡觀察標本。在實驗教學過程中，除了正確引導醫學研究生遵守相差觀察的基本操作方法，同時更為重要的是引導他們對使用相差觀察的標本認識和掌握。對他們來說，在日后的科學研究中，最為常用的是培養細胞的顯微觀察。但是學生在初入研究生階段，可能對培養細胞的器材和細胞形態沒有完整的認識，甚至都未真正接觸，從而不能完全找到正確的視野和正確掌握相差觀察的使用。這就要求教師在教學過程中明確地為研究生講解細胞標本的制備方法，并告訴他們在觀察時應注意的問題。首先，對于細胞器材的選擇，一般建議使用玻璃材質和塑料材質的培養皿、培養板和培養瓶。它們多為無色透明，可直接在倒置熒光顯微鏡上進行觀察，不用倒掉細胞液和經過其他處理。其次，在進行顯微觀察中，不要隨意打開器材的蓋子，以免污染細胞。最后，對于操作人員來說，需佩戴手套、口罩和白大衣，不僅可以保護自身健康而且可以防止細胞污染。

3.熒光觀察的正確使用。倒置熒光顯微鏡的功能之三是熒光觀察，其基本原理是利用激發光激發樣本產生熒光，從而實現樣本的形狀與定位觀察，主要適用于熒光標記樣本的觀察。其基本步驟為：①通過相差觀察步驟找到標本對焦；②打開外置熒光供電器電源開關，長按激發按鈕激發汞燈；③通過關閉倒置熒光顯微鏡左側的白色按鈕開關來關閉白光；④確認熒光的視場光闌、孔徑光闌、供電器上的SHUTER光閘全部打開；⑤確認熒光供電器上的ND旋鈕在1位置、熒光濾色塊轉盤上的熒光光閘在O位置；⑥旋轉熒光濾色塊轉盤，使合適的熒光濾光塊進入光路；⑦用所需的放大倍數物鏡觀察標本。熒光觀察是倒置熒光顯微鏡的重要功能，其配件昂貴且使用特殊。要想醫學研究生正確地掌握熒光觀察的操作使用規范，教師除了教會他們掌握基本的操作方法，同時更為重要的是教會他們掌握它的特殊性。首先，在標本制作中，載玻片和蓋玻片應表面光潔且厚度適宜（載玻片在0.8mm～1.2mm之間，蓋玻片在0.17mm左右）；標本應厚度適宜，同時避免細胞重疊或雜質掩蓋；封裱劑應使用甘油和碳酸鹽緩沖液（0.5mol/L PH9.0～9.5）的等量混合液。其次，在熒光觀察前，應關閉房間內的電燈和倒置熒光顯微鏡的白光，確保處于暗室環境。最后，在熒光觀察中，應嚴格控制觀察時間，一般以1～2小時/次為宜，否則熒光會出現衰減和消失的現象；調整光源時應佩戴防護眼鏡，避免紫外線對眼鏡的傷害。

4.圖像拍攝的正確使用。在科學研究中，不僅要求倒置熒光顯微鏡可以實現多種觀察，而且要求倒置熒光顯微鏡可以實現圖像拍攝。倒置熒光顯微鏡系統通過光電轉換將光學顯微鏡與計算機結合在一起，不僅可以在目鏡上進行顯微觀察，而且可以在計算機上進行實時動態圖像的觀察、編輯和保存。其基本步驟為：①打開電腦，插入軟件加密鎖；②打開桌面軟件NIS-ELEMENTS；③倒置熒光顯微鏡的顯微鏡右側旋鈕，使光路切換至“L”位置，即光路進入相機；④點擊“預覽圖標”，顯示live實時圖像；⑤選擇合適的曝光時間和合適的拍照區域；⑥點擊“標本圖標”，確認當前物鏡倍數是否與軟件一致；⑦點擊拍照按鈕，保存圖像。在實驗教學中，教師除了教會醫學研究生正確使用倒置熒光顯微鏡的三種觀察，還要教會他們如何使用拍照和編輯功能。而在拍照中，應重點強調光路的切換。根據以往的教學經驗，總發現不少研究生未將光路切換至“L”位置就直接進行拍照。另外，還要強調軟件加密鎖的重要性，告誡他們千萬不要損壞和丟失，因為它不僅價格昂貴，而且是圖像拍攝和數據分析的關鍵。

二、倒置熒光顯微鏡的維護與管理

1.倒置熒光顯微鏡的維護。首先，在使用倒置熒光顯微鏡前，應檢查儀器是否良好、環境是否清潔干燥、儀器是否無振動和磁場干擾以及無陽光或紫外消毒燈照射。確認無誤后，輕輕掀開防塵罩，在固定的位置上進行觀察，不要輕易搬動。同時，操作人員與倒置熒光顯微鏡應保持一定的距離，以免發生撞碰。其次，在使用倒置熒光顯微鏡過程中，應當嚴格遵守各個功能的操作使用規范，正確掌握開機順序（先開顯微鏡，再開相機電源，最后開電腦）和關機順序（先關電腦，再關相機電源，最后關顯微鏡），做到不使用熒光不開啟熒光光源、不拍照不開啟電腦；注意避免頻繁開關熒光燈，接通電源和關閉電源的間隔時間不少于30分鐘，以保證熒光汞燈的正常使用壽命；禁止在系統電腦上連接網線和插入U盤或移動硬盤，以免電腦中毒；不得隨意拆取物鏡、目鏡、熒光濾色片等光學部件，不得隨意調節對中旋鈕以免使光路產生偏差，不得大角度曲折熒光光纖以保持自然彎曲，不得使用暴力操作各儀器部件，不得在電源接通或開啟情況下打開燈箱更換燈泡。最后，使用倒置熒光顯微鏡結束后，除熒光觀察外，應及時關掉電源，使用乙醚和無水乙醇的混合液（摻和比例為7∶3）擦拭光學表面，保持倒置熒光顯微鏡的干燥和清潔；不得使用鏡頭紙以外的硬物擦拭鏡頭以免損壞鏡頭鍍膜；若使用圖像拍攝功能，應正確退出軟件加密鎖后，再按正確程序關閉電腦；燈箱冷卻后方可蓋上防塵罩，以免燒壞儀器和發生火災。

2.倒置熒光顯微鏡的管理。由于醫學研究生眾多，而倒置熒光顯微鏡稀少，因此妥善的管理顯得尤為重要。它不僅可以防止倒置熒光顯微鏡的損壞，而且可以提高倒置熒光顯微鏡的使用率。我們可以采取以下管理方案：①先學后用制，即研究生先經過課堂和實驗教學的學習，正確掌握使用方法后才可以使用；②使用登記制，即研究生使用后，需詳細記錄使用情況，記錄中應包括使用時間、使用人員、使用哪種功能和儀器有無異常，具有可追溯性；③專人管理制，即設定專門的管理人員，負責儀器的保管，負責儀器的使用安排，定期對儀器進行檢查和保養；④檔案設定制，即由儀器管理人員建立儀器檔案，內容主要包括使用說明書、生產廠家、生產日期、購置日期、維護和維修記錄等。

參考文獻：

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