欖仁內(nèi)生真菌JLR6的鑒定及其發(fā)酵條件優(yōu)化

郭洪成　吳亞騰　王春龍　柳志強(qiáng)

摘 要 欖仁是熱帶及亞熱帶地區(qū)的一種常見藥用植物，目前關(guān)于欖仁內(nèi)生真菌的研究較少。從欖仁體內(nèi)分離出一株內(nèi)生真菌JLR6，利用對(duì)峙生長(zhǎng)法測(cè)試JLR6對(duì)香蕉炭疽菌及芒果炭疽菌的拮抗活性，通過ITS序列分析對(duì)其進(jìn)行初步鑒定，并利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面的方法對(duì)菌株JLR6的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。 結(jié)果表明：菌株JLR6對(duì)香蕉炭疽菌及芒果炭疽菌有明顯的拮抗活性，皿內(nèi)抑制率分別為45.50%和57.90%，通過ITS序列分析，初步將JLR6鑒定為Diaporthe sp.；優(yōu)化后菌株JLR6的最適發(fā)酵條件為細(xì)菌學(xué)蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母粉17.82 g/L、裝液量87.59 mL、接種量9.06 %，于180 r/min、28℃條件下培養(yǎng)7 d，生物量達(dá)到4.79 g/L。

關(guān)鍵詞 欖仁 ；內(nèi)生真菌 ；Diaporthe sp. ；拮抗活性 ；發(fā)酵條件優(yōu)化

分類號(hào) Q939.95 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.01.008

Abstract Terminalia catappa is a common medicinal plant in tropical and subtropical regions， and there is few study on its endophytic fungi so far. An endophytic fungi JLR6 was isolated from Terminalia catappa， and its antagonistic activity to Colletotrichum musae and Colletotrichum gloeosporioides were determined by confrontation growth method. The strain was identified by ITS sequence analysis， and the fermentation conditions were optimized by Plackett-Burman design and response surface methodology. The results showed strain JLR6 had obvious antagonistic activity to C. musae and C. gloeosporioides， and the inhibition rates were 45.50% and 57.90%， respectively. Strain JLR6 was identified as Diaporthe sp. according to ITS sequence. After optimization， the optimal fermentation conditions were 10 g/L peptone， 20 g/L glucose， 17.82 g/L yeast extract， 87.59 mL of loading volume and 9.06% of inoculum size. After 7 d culture on 28℃， 180 r/min， the biomass was up to 4.79 g/L.

Keywords Terminalia catappa ； endophytic fungi ； Diaporthe sp. ； antagonistic activity ； optimization of fermentation condition

欖仁樹（Terminalia catappa）別名枇杷樹、法國(guó)枇杷，為使君子科（Combretaceae）欖仁樹屬落葉喬木，高15 m或更高，5～6月開花，9月果實(shí)成熟，原產(chǎn)于馬達(dá)加斯加、印度東部和安達(dá)曼群島及馬來半島，在中國(guó)海南、廣東、廣西、臺(tái)灣、福建等地均有分布[1]。

植物內(nèi)生菌（endophyte）指那些在其生活史中的某一段時(shí)期或全部階段生活于健康植物各組織和器官內(nèi)部，不引起被感染的宿主植物組織癥狀明顯改變的菌類，包括那些在其生活史中的某一階段表面生的腐生菌、對(duì)宿主暫時(shí)沒有傷害的潛伏病原菌和菌根菌[2]。內(nèi)生菌在植物體內(nèi)能產(chǎn)生多種生物學(xué)作用，如提供植物所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，參與植物的防衛(wèi)功能，促進(jìn)植物快速生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物抗逆、抗病、抗蟲的能力[3]。因此，內(nèi)生菌對(duì)植物病害的生防作用及其開發(fā)利用引起了廣泛關(guān)注。目前有關(guān)欖仁內(nèi)生菌的研究較少，本研究從欖仁體內(nèi)分離出一株內(nèi)生真菌JLR6， 發(fā)現(xiàn)其對(duì)香蕉炭疽菌及芒果炭疽菌具有較好的拮抗效果，利用ITS 序列分析對(duì)該菌株進(jìn)行了初步鑒定，并通過響應(yīng)面法對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，為今后的應(yīng)用奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

欖仁莖采自海南大學(xué)儋州校區(qū)，內(nèi)生真菌JLR6從欖仁莖中經(jīng)組織表面消毒分離獲得。香蕉炭疽菌（Colletotrichum musae）和芒果炭疽菌（C. gloeosporioides Penz）由海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

CM培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母粉5 g，葡萄糖10 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌株JLR6皿內(nèi)拮抗活性測(cè)定

在直徑為9 cm的PDA平板中央分別接種一塊直徑為5 mm的香蕉炭疽菌、芒果炭疽菌的菌餅，菌絲面朝下，同時(shí)在菌餅一側(cè)接種一塊JLR6菌餅，以不接內(nèi)生真菌JLR6的平板為對(duì)照，每處理3次重復(fù)，于28℃培養(yǎng)7 d，測(cè)試菌株JLR6的皿內(nèi)拮抗活性。

抑菌活性/%=（對(duì)照組病原菌生長(zhǎng)距離-試驗(yàn)組病原菌生長(zhǎng)距離）/對(duì)照組病原菌生長(zhǎng)距離×100

1.2.2 ITS序列分析

菌株JLR6基因組的提取采用CTAB法。利用ITS通用引物（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行基因擴(kuò)增，由上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行Blast分析。

1.2.3 菌株JLR6的發(fā)酵條件優(yōu)化

采用搖瓶試驗(yàn)進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，將菌株JLR6接種于CM培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 d，將種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，按照如下方案進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。Plackett-Burman設(shè)計(jì)：選用11因素、試驗(yàn)次數(shù)為12的Plackett-Burman設(shè)計(jì)，對(duì)5個(gè)因素進(jìn)行2水平設(shè)計(jì)（表1），以生物量為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0進(jìn)行顯著性分析。

對(duì)于Plackett-Burman設(shè)計(jì)選擇的3個(gè)顯著因子A、B、C（酵母粉、裝液量和接種量），根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)（Central Composite Design，CCD）原理，從5個(gè)水平（-α，-1，0，+1，α）進(jìn)行考查（表2），以生物量為響應(yīng)值，確定其最優(yōu)條件。

生物量計(jì)算采用干重法，將菌株發(fā)酵液過濾，收集菌絲體，用去離子水洗滌3次，置于真空干燥箱烘至恒重，稱量并計(jì)算生物量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株JLR6的皿內(nèi)拮抗活性

菌株JLR6在PDA平板上的菌落呈絮狀或絨毛狀，乳白色或灰黑色，菌落邊緣不規(guī)則（圖1）。利用對(duì)峙生長(zhǎng)法測(cè)試了菌株JLR6對(duì)香蕉炭疽菌及芒果炭疽菌的拮抗活性，結(jié)果見圖2。可以看出，菌株JLR6對(duì)2種病原菌均具有明顯的拮抗作用，能夠有效抑制病原菌菌絲在PDA 培養(yǎng)基中的擴(kuò)展。經(jīng)測(cè)定，菌株JLR6對(duì)香蕉炭疽菌及芒果炭疽菌的皿內(nèi)抑制率分別為45.50%和57.90%。

2.2 ITS序列分析

對(duì)菌株JLR6的ITS序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)序，得到605 bp 的堿基序列。將ITS序列進(jìn)行Blast分析，發(fā)現(xiàn)其與Diaporthe屬中多個(gè)菌株（Genbank登錄號(hào)分別為JQ514150，JN153055，EF423532，GQ352484）的同源性達(dá)到99%，因此初步將JLR6鑒定為Diaporthe sp.。

2.3 JLR6發(fā)酵條件的優(yōu)化

為獲得菌株JLR6的最適發(fā)酵條件，首先通過Plackett-Burman試驗(yàn)考察細(xì)菌學(xué)蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、接種量、裝液量5個(gè)因素對(duì)菌體干重的影響，結(jié)果見表3，各因素效應(yīng)結(jié)果見表4。表4中p值表示各因子對(duì)菌體發(fā)酵影響的顯著性，若p值小于0.05，說明該因素對(duì)JLR6發(fā)酵過程的影響顯著。

從表4可以得出，酵母粉、葡萄糖、裝液量和接種量4個(gè)因子的影響是顯著的；F值表征因子對(duì)JLR6生物量的影響程度，F(xiàn)值越大，表明該因子對(duì)生物量的影響程度越大。在JLR6發(fā)酵過程中，裝液量對(duì)其生物量的影響最大，其次是接種量和酵母粉，葡萄糖影響相對(duì)較小，而細(xì)菌學(xué)蛋白胨對(duì)生物量的影響不顯著。經(jīng)過Plackett-Burman試驗(yàn)，將酵母粉、裝液量和接種量3個(gè)顯著因子做進(jìn)一步優(yōu)化，以確定最適水平。

針對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)確定的3個(gè)顯著因子（酵母粉、裝液量和接種量）進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。借助Design expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到二次回歸方程為：

Y=4.49+0.5A+0.13B+0.11C-0.041AB+0.016AC+0.071BC-0.28A2-0.13B2-0.17C2

其中，Y表示JLR6生物量。從表6可以看出，該模型的p值<0.01，R2=97.6%，說明該模型能夠較好地模擬JLR6的發(fā)酵過程。

依據(jù)回歸方程做響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖3、4。圖3表示接種量為9.06%時(shí)，酵母粉濃度和裝液量對(duì)JLR6生物量的交互影響，可以看出酵母粉濃度和裝液量分別在16～20 g/L和80～90 mL時(shí)，生物量較大。圖4表示酵母粉濃度為17.82 g/L時(shí)，裝液量和接種量對(duì)JLR6生物量的交互影響，當(dāng)裝液量和接種量分別在80～90 mL和9%～10%時(shí)，菌株JLR6生物量較大。通過軟件進(jìn)一步分析計(jì)算，得到預(yù)測(cè)最大生物量為4.678 g/L，此時(shí)酵母粉濃度為17.82 g/L，裝液量為87.59 mL，接種量為9.06%。

為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性和有效性，按照優(yōu)化后的最適發(fā)酵條件（細(xì)菌學(xué)蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母粉17.82 g/L，裝液量87.59 mL，接種量9.06%），于180 r/min、28℃條件下培養(yǎng)7 d，測(cè)得生物量為4.79 g/L，與預(yù)測(cè)值4.69 g/L相接近，說明試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)面分析方法能夠較好地模擬JLR6的發(fā)酵過程，結(jié)果可靠。

4 討論與結(jié)論

欖仁是熱帶及亞熱帶地區(qū)的一種常見藥用植物，民間常用于防治肝炎、肝腹水、肝癌等各種肝病，功效顯著[4]。目前關(guān)于欖仁的研究多集中于其藥用活性及藥理機(jī)制方面，如一些研究者發(fā)現(xiàn)，欖仁葉提取物對(duì)急慢性肝損傷具有一定的防護(hù)作用， 其機(jī)理可能與其對(duì)抗脂質(zhì)過氧化、保護(hù)線粒體及肝細(xì)胞有關(guān)[4-5]。但目前關(guān)于欖仁內(nèi)生真菌的研究報(bào)道很少，本研究從欖仁體內(nèi)分離出一株內(nèi)生真菌JLR6，發(fā)現(xiàn)其對(duì)香蕉炭疽菌及芒果炭疽菌均有較好的拮抗活性，其皿內(nèi)拮抗活性分別為45.50%和57.90%，通過ITS序列分析初步將其鑒定為Diaporthe sp.。

近年來，國(guó)內(nèi)外已篩選到多株可用于香蕉炭疽病的生防菌株，涉及細(xì)菌、放線菌、酵母、絲狀真菌等，例如Streptomyces aureofaciens[6]、Trichoderma harzianum[7]、Pichia anomala[8]、Candida oleophila[8]、Pseudomonas syringae[9]、Burkholderia spinosa[10]、Bacillus amyloliquefaciens[11]、Pantoea agglomerans[12]、Bacillus subtilis[13]和Pseudomonas fluorescens[14]等；在芒果炭疽病生防菌的篩選方面也取得了不少進(jìn)展，研究發(fā)現(xiàn)Bacillus subtilis[15]、Bacillus amyloliquefaciens[16]、綠色木霉菌[17]、季也蒙畢赤酵母[18]、Meyerozyma caribbica[19]和Cryptococcus laurentii[20]等對(duì)芒果炭疽病具有較好的防治效果。然而，目前還未見有關(guān)Diaporthe sp.用于香蕉炭疽菌及芒果炭疽菌防治的報(bào)道。

傳統(tǒng)的發(fā)酵條件優(yōu)化方法如單因素優(yōu)化法，存在數(shù)據(jù)利用率不高、試驗(yàn)次數(shù)多及試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確等問題[21]。Plackett-Burman設(shè)計(jì)是一種2水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，它可以利用較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，從眾多的考察因素中快速有效地篩選出主要的影響因子，被廣泛應(yīng)用于因子主效應(yīng)的估計(jì)[22]。響應(yīng)面法是一種優(yōu)化生物過程的綜合技術(shù)，采用該法可以建立連續(xù)變量曲面模型，對(duì)影響生物產(chǎn)量的因子水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)[23]，響應(yīng)面法已經(jīng)被成功應(yīng)用于許多發(fā)酵過程的優(yōu)化當(dāng)中[24-26]。本研究利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)JLR6的發(fā)酵條件進(jìn)行了篩選，獲得了3個(gè)主要的顯著因子，即酵母粉濃度、裝液量和接種量。利用響應(yīng)面法對(duì)3個(gè)顯著因子進(jìn)行優(yōu)化，建立了二次多項(xiàng)方程模型，獲得了最適的發(fā)酵條件，在驗(yàn)證試驗(yàn)中得到的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值接近，模擬結(jié)果較好。

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