一株拮抗香蕉枯萎病菌內生細菌的抑菌機制研究

劉先寶　蔡吉苗　陳奕鵬　黃貴修

摘 要 采用生物化學方法，分析了一株香蕉內生細菌BEB99發酵液的乙酸乙酯粗提物對香蕉枯萎病菌4號小種（FOC4）的抑菌機制，結果表明，其對香蕉枯萎病菌菌絲脂質過氧化、麥角甾醇含量、蛋白質含量及果膠酶活性均有一定的影響，但不能產生幾丁質酶。

關鍵詞 內生細菌 ；勞爾氏菌 ；尖孢鐮刀菌；抑菌機制

分類號 S432.4+2 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.01.010

Abstract The antagonistic mechanisms of ethyl acetate crude extract of BEB99 strains for Fusarium oxysporium were studied by biological chemical method. The results revealed that ethyl acetate crude extract could influence lipid peroxidation， ergosterol content， protein content， the activity of PMG of Fusarium oxysporum. But it could not decompose the chitin.

Keywords Endophytic bacteria ； Ralstonia sp. ； Fusarium oxysporum ； antimicrobial mechanism

植物內生細菌是指生活于植物的組織和器官內部而不引起癥狀的細菌，其中很多菌種在病害生物防治和促進植物生長發育等方面具有潛在的應用價值[1]。內生細菌的生防機制主要包括競爭作用、拮抗作用和誘導抗性，其中拮抗作用是生防菌主要的抗菌機制。生防菌產生的拮抗物質主要包括細胞壁降解酶類，如幾丁質酶或葡聚糖酶、抗菌蛋白、抗菌肽和揮發性物質等[2]。

香蕉是中國重要的熱帶經濟作物。由尖孢鐮刀菌古巴專化型引起的香蕉枯萎病是一種毀滅性的土傳病害。已有研究表明，利用內生細菌生物防治香蕉枯萎病具有較好的防治效果[3]。本實驗室以香蕉枯萎病菌為指示菌，經篩選獲得一株具有抑菌活性的內生細菌BEB99，該菌株經鑒定為勞爾氏菌（Ralstonia sp.），其發酵液的石油醚和乙酸乙酯粗提物對香蕉枯萎病菌的菌絲生長和孢子萌發均具有明顯的抑制作用，可造成病菌菌絲的畸形，抑制孢子萌發。為進一步了解該菌對香蕉枯萎病菌的作用機制，筆者研究了該菌發酵液的乙酸乙酯粗提物對菌絲脂質過氧化、麥角甾醇含量、蛋白質含量及果膠酶活性的影響，以期為該菌株下一步的應用研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

香蕉內生細菌BEB99和香蕉枯萎病病菌尖孢鐮刀菌古巴專化型4號小種（Fusarium oxysporium f. sp. cubense （Smith） Snyder & Hansen race 4， FOC4）均由本實驗室分離和保存。

1.1.2 培養基和試劑

NA培養基、優化培養基（4 g/L葡萄糖，1 g/L酸水解酪蛋白，0.5 ml/L的1 mol/L MgCl2，1 ml/L的1 mol/L CaCl2，pH 6.5）、PDA培養基、PDB培養基、乙酸乙酯、幾丁質培養基（膠狀幾丁質15 g，酵母膏3 g，KH2PO4 1.36 g，NH4SO4 1 g，MgS04·5H2O 0.3 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL）。

1.2 方法

1.2.1 BEB99菌株發酵液制備

將保存的內生細菌BEB99菌株接種于優化平板培養基中，于28℃中活化24 h；將活化的BEB99菌株接入50 mL優化的液體培養基中（150 mL三角瓶），于28℃、180 r/min條件下振蕩培養36 h，制成種子液；再將種子液以7%的接種量接入優化培養液中，于相同條件下培養36 h，制備BEB99菌株的發酵液。

1.2.2 BEB99菌株發酵產物分離

將濃縮的發酵產物用細胞超聲破碎儀破碎后，用250 mL乙酸乙酯有機溶劑與發酵液等體積混合，在1 000 mL分液漏斗中反復顛倒振蕩30 min，使其萃取充分，靜置過夜，萃取3次，合并有機相，將有機相減壓濃縮成浸膏，用乙酸乙酯溶劑定容，備用。

1.2.3 菌絲體處理方法

將FOC4分生孢子懸浮液接種于50 mL PDB中（分生孢子最終濃度為1×107 個/mL），于28 ℃靜置培養5 d；加入乙酸乙酯相提取物使其終濃度分別為50、100、150 μg/mL，繼續靜置培養5 d；用濾紙過濾備用。

1.2.4 BEB99菌株發酵產物對FOC4菌絲脂質過氧化影響測定

參照趙世杰等[4]的方法測定菌株BEB99乙酸乙酯相提取物對FOC4菌絲細胞膜脂質過氧化的影響。

1.2.5 BEB99菌株發酵產物對FOC4菌絲麥角甾醇影響測定

參考韓平等[5]的方法測定抑菌物質對菌絲細胞膜組成成分麥角甾醇的影響。

1.2.6 BEB99菌株發酵產物對FOC4菌絲蛋白質含量影響測定

參照何璐[6]的方法測定BEB99菌株發酵產物對FOC4菌絲蛋白質含量的影響

1.2.7 BEB99菌株發酵產物對FOC4病菌胞外果膠酶活性影響測定

參照何璐[6]的方法測定BEB99菌株發酵產物對FOC4病菌果膠酶活性的影響。

1.2.8 BEB99菌株發酵產物對FOC4菌株幾丁質影響測定

將幾丁質培養基倒平板后，把牛津杯插入平板中央，吸取20 μL乙酸乙酯相提取物加入牛津杯中，以乙酸乙酯溶劑為對照，3次重復；于28℃中培養3 d，觀察牛津杯周圍是否有透明圈。

2 結果與分析

2.1 BEB99菌株發酵產物對FOC4菌絲脂質過氧化的影響

丙二醛（MDA）是細胞膜脂質過氧化的產物，其含量高低表示細胞膜受損害程度。由表1可看出，經菌株BEB99乙酸乙酯相提取物處理后，FOC4菌絲體細胞膜的脂質過氧化產物丙二醛含量增加，均顯著高于對照，且不同處理間也存在顯著差異。隨著活性產物提取物濃度的升高，丙二醛含量逐漸上升，表明隨著抑菌物質濃度的升高，病原菌細胞膜受到損害的程度越來越大。

2.2 BEB99菌株發酵產物對FOC4菌絲麥角甾醇含量的影響

麥角甾醇是菌體細胞膜上的重要組成物質。菌株BEB99乙酸乙酯相提取物對麥角甾醇含量的影響結果見表2，隨著活性產物提取物濃度的升高，麥角甾醇的含量不斷增加，顯著高于對照，并且不同處理間也存在顯著差異。說明BEB99乙酸乙酯相提取物是抑制香蕉枯萎病菌的作用物質之一。

2.3 BEB99菌株發酵產物對FOC4菌絲蛋白質含量的影響

繪制牛血清蛋白標準曲線（圖1），標準曲線為y=0.003 x+0.122，R2=0.947。

樣品溶液蛋白質含量測定結果見表3，用不同濃度的菌株BEB99乙酸乙酯相提取物處理相同質量的FOC4菌絲后，各處理樣品的蛋白質含量隨活性產物提取物濃度的增大而降低，當提取物濃度為100、150 μg/mL時，蛋白質的含量不存在顯著差異，但不同處理均與對照之間存在顯著差異，說明提取物對FOC4菌絲中蛋白質的含量影響顯著。

2.4 BEB99菌株發酵產物對FOC4菌株胞外果膠酶活性的影響

繪制葡萄糖標準曲線（圖2），標準曲線為y=0.869 x-0.028，R2=0.998。

在540 nm處測得的OD值如表4所示，在葡萄糖標準曲線上查得還原糖含量，進而計算出果膠酶的活性。各處理樣品的果膠酶活性隨乙酸乙酯相提取物濃度的增大而略有降低，且均顯著低于對照，同時不同處理間也存在顯著差異，說明提取物對FOC4菌絲中果膠酶的合成存在顯著影響。

2.5 BEB99菌株發酵產物對FOC4菌株幾丁質的影響

幾丁質在培養基上呈白色不溶性微粒狀，在幾丁質水解酶的作用下被水解成可溶性的小分子，呈透明狀。取20 μL乙酸乙酯相提取物注入牛津杯，在幾丁質培養基上培養3 d后發現，牛津杯周圍未出現透明的水解圈，即菌株BBE99乙酸乙酯相提取物不能水解病原菌細胞壁結構的組成成分幾丁質。

3 討論

目前，有關生防內生菌抗菌機制的研究大部分僅限于其對病原菌活體的防效及其對菌絲生長、孢子形成和萌發的影響，對于其毒理作用涉及較少[7]。本研究分析了菌株BEB99的乙酸乙酯相提取物對FOC4菌絲細胞組成和代謝的影響。脂質和麥角甾醇是細胞膜的主要組成部分，脂質過氧化反映了細胞膜受損害的程度，而丙二醛是脂質過氧化的產物。研究發現，隨著菌株BEB99的乙酸乙酯相提取物濃度的升高，細胞膜的脂質過氧化增強（即脂質過氧化產物丙二醛含量增加），麥角甾醇含量增加，表明損壞細胞膜結構是菌株BEB99抑制香蕉枯萎病菌的作用方式之一，這與王芳[7]提出的作用機制（內生枯草芽抱桿菌抗菌物質與病原菌細胞膜上的卵磷脂類物質結合形成復合體導致膜的穿孔，從而破壞串珠鐮刀菌質膜）不同。幾丁質是真菌細胞壁的重要組成物質。本研究發現，菌株BEB99乙酸乙酯相提取物不能產生幾丁質酶來水解幾丁質或者破壞幾丁質的合成，而其對香蕉枯萎病菌細胞壁其他組成物質是否有影響還需進一步研究。

在菌株BEB99抗菌物質影響病原菌菌體細胞內代謝物質的合成方面，研究了其對香蕉枯萎病菌菌絲體中蛋白質含量的影響，結果表明，利用不同濃度的菌株BEB99乙酸乙酯相提取物處理相同質量的FOC4菌絲后，各處理樣品的蛋白質含量隨提取物濃度增大而降低，當提取物濃度為100、150 μg/mL時，蛋白質的含量不存在顯著差異，但各處理均與對照之間存在顯著差異，說明菌株BEB99乙酸乙酯相提取物對FOC4菌絲中蛋白質的含量存在顯著影響。董章勇等[8]提出，果膠酶是香蕉枯萎病菌的主要致病毒力因子。本研究發現，供試菌株的乙酸乙酯相提取物對香蕉枯萎病菌合成的果膠酶具有顯著影響，隨著其濃度的升高，果膠酶活性顯著降低，這將降低病原菌致病毒力，這與王芳[7]提出的的抗菌物質對番茄葉霉病菌胞外酶活性的抑制效果相一致。綜合本研究的結果可知，菌株BEB99乙酸乙酯相提取物能夠抑制香蕉枯萎病病原菌的菌絲果膠酶活性和蛋白質的含量，并通過破壞細胞膜結構產生抑菌作用，而抗菌物質對病菌菌絲細胞壁的組成物質幾丁質沒有影響，其作用機理的研究可為更加有效地應用菌株BEB99奠定基礎，在實踐上具有重要的應用價值，值得進一步開發利用。

參考文獻

[1] Jesús Mercado-Blanco， Ben J J. Lugtenberg. Biotechnological Applications of Bacterial Endophytes[J]. Current Biotechnology， 2014， 3（3）： 60-75.

[2] Ryan R P， Germaine K， Franks A， et al. Bacterial endophytes： recent developments andapplications[J]. FEMS Microbiol Lett， 2008， 278（1）： 1-9.

[3] Ting A S Y， Meon S， Kadir J， et al. Endophytic microorganisms as potential growth promoters of banana[J]. BioControl， 2008， 53（3）： 541-553.

[4] 趙世杰，許長成，鄒 琦，等. 植物組織中丙二醛測定方法的改進[J]. 植物生理學通訊，1991，30（3）：207-210.

[5] 韓 平，劉西莉，劉鵬飛，等. 高效液相色譜法研究啶菌惡唑對番茄灰霉病菌麥角甾醇生物合成的影響[J]. 分析化學，2006，10（2）：78-82.

[6] 何 璐. 苦參內生真菌抑菌物質純化鑒定及作用機制研究[D]. 沈陽： 沈陽農業大學， 2011.

[7] 王 芳. 苦參內生拮抗細菌篩選及其抗菌物質純化鑒定[D]. 沈陽：沈陽農業大學，2009.

[8] 董章勇，王 琪，秦世雯，等. 香蕉枯萎病菌1號和4號生理小種細胞壁降解酶的比較[J]. 植物病理學報，2010，40（5）：463-468.