Roscovitine在衣霉素誘導足細胞損傷中的保護作用

高翔，張悅，張愛金，付芃，李佳琳，吳建，劉巍△

?

Roscovitine在衣霉素誘導足細胞損傷中的保護作用

高翔1,2，張悅3，張愛金1，付芃1，李佳琳1，吳建1，劉巍1△

摘要：目的應用衣霉素誘導內質網應激（ERS），觀察Roscovtine對ERS導致足細胞損傷的保護作用。方法體外培養永生化小鼠足細胞，取37℃分化成熟細胞隨機分組：（1）正常對照組、DMSO組及衣霉素Tunicamycin（1.0 μmol/L，TM）組，各實驗組分別刺激3、6、12 h。（2）正常對照組、Tunicamycin（1.0 μmol/L，TM）組及Tunicamycin+Rosco?vitine（20、40 μmol/L，TM+ROS）組，各實驗組分別刺激12 h。應用流式細胞術及TUNEL法檢測足細胞凋亡情況；應用Western blot檢測細胞周期素依賴性蛋白激酶5（Cdk5）及ERS標志蛋白GRP78、Caspase-12、CHOP的表達變化。結果（1）與正常對照組和DMSO組相比，Tunicamycin刺激3、6及12 h后，TM組足細胞凋亡率及Cdk5、GRP78、Caspase-12和CHOP蛋白的表達水平均呈明顯的時間依賴性增高（P < 0.05）；（2）加入Roscovitine干預后，與TM組相比，TM+ROS（20、40 μmol/L）組足細胞凋亡率及GRP78、Caspase-12和CHOP蛋白的表達水平均顯著降低（P < 0.05），其干預作用呈現明顯的劑量依賴性。結論Cdk5抑制劑Roscovitine能顯著抑制衣霉素誘導的足細胞凋亡，從而發揮細胞保護作用。Roscovitine的足細胞保護作用可能有助于糖尿病腎病的治療。

關鍵詞：足細胞；凋亡；衣霉素；細胞周期素依賴性蛋白激酶5；內質網應激；Roscovitine

△通訊作者E-mail：lwei929@126.com

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病重要的血管并發癥，是導致糖尿病患者死亡的重要原因之一。研究顯示，足細胞作為腎小球濾過屏障的重要組成部分，其損傷在DN蛋白尿和腎小球硬化的進展中發揮了重要作用[1]。內質網應激（en?doplasmic reticulum stress，ERS）是細胞對各種有害刺激最為關鍵的應答機制，而過度ERS可直接導致細胞功能異常甚至死亡。已有研究顯示，過度ERS導致的足細胞凋亡在DN的發生發展中發揮了重要作用[2]。因此，有效地抑制ERS可能會成為治療DN的新方向。然而，目前尚沒有針對DN的特異性ERS抑制劑。本課題組前期研究發現，1型糖尿病大鼠的細胞周期素依賴性蛋白激酶（Cdk）5在足細胞的表達較正常對照大鼠明顯增高，Cdk5參與了ERS介導的細胞凋亡過程，并與大鼠腎功能受損程度密切相關；而Cdk5抑制劑Roscovitine能明顯改善糖尿病大鼠的腎功能，減輕腎組織病變程度[3]。但是，Roscovitine發揮細胞保護作用的具體機制尚不清楚。本研究通過衣霉素（Tunicamycin，TM）誘導小鼠足細胞凋亡，探討Roscovitine對足細胞過度ERS的影響，以期為DN的治療提供新思路。

1　材料與方法

1.1材料條件性永生化小鼠足細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心。Cdk5抗體購自美國Epitomics公司；β-actin、GRP78購自美國SAB公司；Caspase-12購自美國Abcam公司；CHOP購自Cell Signaling Technology公司。TM、Roscovitine和Ⅰ型膠原蛋白購自美國Sigma公司。DMEM培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司。重組小鼠γ-干擾素（γ-interferon，γ-IFN）購自美國PeproTech公司。TUNEL凋亡檢測試劑盒購自美國羅氏公司。Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養條件性永生化小鼠足細胞培養方法參照文獻[4]。培養時，培養瓶及培養板底部均預先鋪被0.1 g/L的Ⅰ型膠原蛋白。未分化足細胞用含有10%胎牛血清（FBS）、20 U/mL γ-IFN、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基在33℃、5% CO2培養箱中培養，促進細胞增殖傳代（許可條件）。許可條件下培養的足細胞按1∶10傳代后，在37℃用不添加γ-IFN的DMEM培養基（含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素）培養10～15 d（非許可條件），誘導足細胞分化成熟。

1.2.2實驗分組足細胞在無血清培養基培養24 h后進行后續實驗。（1）觀察TM對足細胞凋亡及蛋白表達的影響，細胞分組：正常對照（Control）組、DMSO組、TM（1.0 μmol/L）組，分別刺激3、6、12 h。（2）觀察Roscovitine對TM誘導足細胞凋亡及蛋白表達的影響，細胞分組如下：正常對照（Control）組；TM（1.0 μmol/L）組；TM+Roscovitine（20、40 μmol/L，TM+ ROS）組，各實驗組分別刺激12 h。

1.2.3流式細胞術檢測足細胞凋亡按1.2.2（1）、（2）分組并培養細胞，各實驗組細胞刺激結束后，加入胰酶-EDTA消化細胞，室溫1 000 r/min離心4 min，棄上清，加生理鹽水洗滌2次。收集1×105個細胞，并加入500 μL Binding buffer，反復吹打均勻制成單細胞懸液；分別加入5 μL FITC標記的An? nexin V和5 μL碘化丙啶(PI)，混勻后避光室溫孵育10 min。流式細胞儀檢測細胞凋亡率，計算各組細胞Annexin-FITC 和PI染色細胞百分含量。

1.2.4Western blot檢驗相關蛋白表達按1.2.2（1）、（2）分組并培養細胞，收集各組細胞，提取總蛋白并行Western blot檢測蛋白表達水平。各組蛋白樣品分別取100 μg總蛋白，加6×上樣緩沖液，100℃變性5 min，經10% SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉37℃封閉2 h，加入Cdk5（1∶1 000）、GRP78（1∶1 000）、Caspase-12（1∶500）、CHOP（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000）抗體，4℃孵育過夜。TBST洗膜后，加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或鼠免疫球蛋白（Ig）G（1∶5 000），37℃孵育2 h。TBST洗膜后，滴加ECL試劑，于Odyssey FC圖像采集成像系統中顯影，并對條帶進行定量分析。以目的條帶和β-actin條帶積分光密度值比值作為最終結果。

1.2.5TUNEL檢測細胞凋亡率以末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）法，按試劑盒說明進行細胞凋亡檢測，DAPI復染細胞核。凋亡足細胞核呈綠色熒光。每張切片于凋亡細胞分布區域隨機讀取10個高倍視野，計算出平均每100個細胞中的凋亡細胞數，以百分數（%）表示凋亡百分率，每張切片重復3次。

1.3統計學方法采用SPSS 13.0統計軟件進行統計。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較采用方差分析，組間多重比較用LSD-t法。P < 0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1TM對足細胞凋亡的影響TM分別處理3、6及12 h后，與對照組和DMSO組相比，TM組足細胞凋亡率均增高（P < 0.05）。同時，TM對足細胞凋亡的影響呈明顯的時間依賴性（P < 0.05），見表1、圖1。

2.2TM對足細胞中Cdk5、GRP78、Caspase-12、CHOP表達的影響與Control組和DMSO組相比，TM刺激3、6及12 h后，足細胞中Cdk5、GRP78、Caspase-12及CHOP蛋白的表達水平均顯著增高（均P < 0.05），并呈明顯的時間依賴性（P < 0.05），見表2、圖2。

Tab.1 The podocyte apoptotic rates treated by TM in three groups表1　TM處理后各組足細胞的凋亡率（n=3，%，±s）

Tab.1 The podocyte apoptotic rates treated by TM in three groups表1　TM處理后各組足細胞的凋亡率（n=3，%，±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較；b與DMSO組比較；A與3 h組比較；B與6 h組比較，P < 0.05

組別Control組DMSO組TM組F 3 h 3.26±0.74 3.11±0.29 13.79±0.95ab265.66＊6 h 2.99±0.39 3.16±0.62 22.38±1.61abA481.13＊12 h 4.36±0.94 3.97±0.56 34.87±2.56abAB522.96＊F 6.35 0.17 328.71＊

Fig.1 The podocyte apoptotic rates after TM treatment in four groups圖1　TM刺激后各組足細胞凋亡率

Tab. 2 The integrated optical density of proteins after TM treatment in four groups表2　TM刺激后各組足細胞蛋白表達的積分光密度值（n=3，±s）

Tab. 2 The integrated optical density of proteins after TM treatment in four groups表2　TM刺激后各組足細胞蛋白表達的積分光密度值（n=3，±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較,b與DMSO組比較,c與TM 3 h組比較，d與TM 6 h組比較,P＜0.05

組別Control組DMSO組TM 3 h組TM 6 h組TM 12 h組F Cdk5 0.17±0.05 0.24±0.06 0.51±0.09ab0.67±0.03abc0.83±0.06abcd56.45＊GRP78 0.42±0.13 0.40±0.08 0.86±0.05ab1.09±0.13abc1.33±0.17abcd34.41＊Caspase-12 0.16±0.03 0.24±0.02 0.41±0.09ab0.53±0.05abc0.66±0.08abcd33.55＊CHOP 0.06±0.03 0.06±0.02 0.34±0.08ab0.59±0.07abc0.78±0.06abcd96.14＊

Fig.2 Expressions of Cdk5, GRP78, Caspase-12 and CHOP after TM treatment in four groups圖2　TM刺激后各組Cdk5、GRP78、Caspase-12和CHOP蛋白的表達情況

2.3Roscovitine對TM誘導足細胞凋亡的影響TM組足細胞凋亡率高于Control組、TM+ROS(20 μmol/L)組和TM+ROS(40 μmol/L)組，并且TM+ROS（40 μmol/L）組細胞凋亡率低于TM+ROS（20 μmol/L）組，Control組凋亡率最低（均P < 0.05）。TUNEL檢測結果顯示，應用Roscovitine干預后，TM+ROS組足細胞凋亡率均顯著低于TM組（均P < 0.05），見表3、圖3。

Tab. 3 Podocyte apoptotic rates detected by flow cytometry and TUNEL after roscovitine treatment表3　流式細胞術和Tunel檢測Roscovitine處理后足細胞凋亡率?。╪=3，%，±s）

Tab. 3 Podocyte apoptotic rates detected by flow cytometry and TUNEL after roscovitine treatment表3　流式細胞術和Tunel檢測Roscovitine處理后足細胞凋亡率?。╪=3，%，±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較；b與TM組比較；c與TM+ROS(20 μmol/L)組比較，P < 0.05；表4同

組別Control組TM組TM+ROS(20 μmol/L)組TM+ROS(40 μmol/L)組F流式細胞術4.82±0.60 37.96±3.54a21.63±1.31ab14.04±1.77abc177.20＊TUNEL 3.19±0.52 38.46±3.31a20.97±1.31ab14.18±1.02abc238.42＊

Fig. 3 The podocyte apoptosis detected by TUNEL (×400)圖3　TUNEL法檢測足細胞凋亡（×400）

2.4Roscovitine對TM誘導足細胞中GRP78、Cas?pase-12和CHOP表達的影響與TM組相比，TM+ROS(20 μmol/L)組和TM+ROS(40 μmol/L)組足細胞中GRP78、Caspase-12和CHOP的蛋白表達水平降低（P < 0.05），并且TM+ROS(40 μmol/L)組較TM+ROS(20 μmol/L)組的作用效果更顯著，但這2組蛋白表達水平仍高于Control組（P < 0.05），見表4、圖4。

Tab. 4 The integrated optical density of proteins after roscovitine treatment表4　Roscovitine處理后各組足細胞蛋白表達的積分光密度值?。╪=3，±s）

Tab. 4 The integrated optical density of proteins after roscovitine treatment表4　Roscovitine處理后各組足細胞蛋白表達的積分光密度值?。╪=3，±s）

組別Control組TM組TM+ROS(20 μmol/L)組TM+ROS(40 μmol/L)組F GRP78 0.46±0.05 2.23±0.38a1.48±0.08ab0.94±0.12abc40.51＊Caspase-12 0.33±0.04 1.88±0.07a0.81±0.08ab0.48±0.05abc349.56＊CHOP 0.28±0.06 2.33±0.38a1.16±0.16ab0.71±0.03abc53.54＊

Fig. 4 Expressions of GRP78, Caspase-12 and CHOP after roscovitine treatment in four groups圖4　Roscovitine處理后各組GRP78、Caspase-12和CHOP蛋白的表達情況

3　討論

足細胞是一種終末分化的腎小球上皮細胞，附著于腎小球基底膜外側，是參與構成腎小球濾過屏障的關鍵結構。足細胞數目及密度的下降是導致DN蛋白尿產生和腎小球硬化的重要原因。凋亡是造成足細胞數目減少的重要原因之一[5]。

一般情況下，內質網的正常生理功能主要是折疊、修飾和降解分泌蛋白和跨膜蛋白；生理和病理狀態下，大量未折疊蛋白在內質網中蓄積會導致ERS的發生。糖尿病狀態下，高糖、ROS、游離脂肪酸、糖基化終產物等因素會導致內質網中大量未折疊蛋白的產生，從而誘發ERS。ERS導致腎臟固有細胞，如系膜細胞、足細胞凋亡，是促進DN發生發展的重要因素[6-7]。因此，抑制ERS可能成為治療DN的一個重要方法。為了研究DN進展中ERS對足細胞的影響，本研究采用TM刺激足細胞，誘導ERS的發生，結果顯示，TM處理后足細胞內ERS標志蛋白GRP78的表達水平高于Control組，并且隨處理時間的延長，ERS相關凋亡蛋白Caspase-12和CHOP的表達水平及足細胞的凋亡率也有增高，提示TM的刺激可以誘導足細胞ERS及凋亡的發生。

ERS發生后主要通過ATF6、IRE1和PERK三種跨膜蛋白傳遞信號，調節內質網功能，從而減輕細胞損傷或誘導細胞凋亡[6]。然而，目前尚不清楚是否有其他蛋白介導了ERS引起的細胞凋亡過程。Cdk5是Cdk家族的特殊成員，是脯氨酸限制性絲/蘇氨酸蛋白激酶，普遍存在于哺乳動物的細胞內。在氧化應激、高血糖、缺氧等因素下，Cdk5可被過度激活并過度磷酸化某些底物，從而導致細胞凋亡，參與多種疾病的發生[8]。腎組織中，Cdk5表達于足細胞中，對維持足細胞的正常結構及功能有重要作用[9]。在高糖環境中，足細胞中Cdk5的表達水平及激酶活性有顯著的增高，而抑制Cdk5的表達可以顯著降低高糖誘導的足細胞凋亡，Cdk5的過度表達及過度激活是導致糖尿病足細胞凋亡的原因[10]。Kang等[11]發現，Cdk5參與了常染色體顯性色素性視網膜炎中ERS導致的細胞凋亡過程，但其是否參與ERS誘導的足細胞凋亡過程尚不清楚。本研究顯示，TM處理后，足細胞中Cdk5的蛋白表達水平顯著高于Control組，并呈明顯的時間依賴性，提示ERS可能通過提高Cdk5的表達水平而誘導足細胞凋亡。

Roscovitine是一種強效的二代細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，對Cdk5的激酶活性具有高效的抑制作用[12]。高濃度Roscovitine處理Heymann腎炎大鼠模型結果顯示，其對腎小球中足細胞有很好的保護作用[13]。筆者前期研究顯示，應用Roscovi?tine處理糖尿病大鼠，能夠有效地減輕糖尿病大鼠腎功能的損傷及病理改變，具有明顯的腎臟保護作用[3]。本研究顯示TM誘導的足細胞凋亡可以被Roscovitine抑制，足細胞凋亡率在Roscovitine干預組顯著低于單純TM處理組，并且40 μmol/L的干預效果顯著優于20 μmol/L組。同時，Western blot結果顯示，Roscovintine的干預可以顯著降低足細胞中ERS相關凋亡蛋白CHOP和Caspase-12的表達水平，表明Cdk5明顯參與了ERS誘導的足細胞凋亡過程，采用Roscovitine抑制Cdk5活性對降低ERS導致的足細胞凋亡具有良好的效果，具有一定的腎臟保護作用。

綜上所述，在DN發展過程中，ERS可通過增強Cdk5的表達而誘導足細胞凋亡，抑制Cdk5可能會成為治療DN的新靶點。雖然大量體內外研究證實Roscovitine可通過抑制Cdk5發揮神經、腎臟等保護功能，并且可以從不同方面干預DN的進展，然而還缺乏長期、大量的臨床研究證實。本研究結果為DN的防治提供了新的思路和方向。

參考文獻

[1] Reidy K, Kang HM, Hostetter T, et al. Molecular mechanisms of dia?betic kidney disease [J]. J Clin Invest, 2014, 124(6):2333-2340. doi: 10.1172/JCI72271.

[2] Zhuang A, Forbes JM. Stress in the kidney is the road to pERdition: is endoplasmic reticulum stress a pathogenic mediator of diabetic nephropathy [J]? J Endocrinol, 2014, 222(3):R97-111. doi: 10.153 0/JOE-13-0517.

[3] Zhang Y, Zhou Y, Zhang Y, et al. Effects of Cdk5 inhibitor Roscovi?tine on renal function and nestin expression in diabetic rat [J]. Chi?nese Pharmacological Bulletin, 2013, 29(8):1077-1078. [張悅,周毅，張怡,等. Cdk5抑制劑Roscovitine對糖尿病大鼠腎功能及nestin表達的影響[J].中國藥理學通報, 2013, 29(8):1077-1078].

[4] Mundel P, Reiser J, Zú?iga Mejía Borja A, et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines [J]. Exp Cell Res, 1997, 236:248-258.

[5] Anil Kumar P, Welsh GI, Saleem MA, et al. Molecular and cellular events mediating glomerular podocyte dysfunction and depletion in diabetes mellitus [J]. Front Endocrinol (Lausanne), 2014, 5:151. doi: 10.3389/fendo.2014.00151.

[6] Madhusudhan T, Wang H, Dong W, et al. Defective podocyte insu?lin signalling through p85-XBP1 promotes ATF6-dependent mal?adaptive ER-stress response in diabetic nephropathy [J]. Nat Com?mun, 2015, 6:6496. doi: 10.1038/ncomms7496.

[7] Ding Y, Choi ME. Autophagy in diabetic nephropathy [J]. J Endocri? nol, 2015, 224(1):R15-30. doi: 10.1530/JOE-14-0437.

[8] Arif A. Extraneuronal activities and regulatory mechanisms of the atypical cyclin- dependent kinase Cdk5 [J]. Biochem Pharmacol, 2012, 84(8):985-993. doi: 10.1016/j.bcp.2012.06.027.

[9] Griffin SV, Hiromura K, Pippin J, et al. Cyclin-dependent kinase 5 is a regulator of podocyte differentiation, proliferation, and morphol?ogy [J]. Am J Pathol, 2004, 165(4):1175-1185.

[10] Zhang Y, Li H, Hao J, et al. High glucose increases Cdk5 activity in podocytes via transforming growth factor-β1 signaling pathway [J]. Exp Cell Res, 2014, 326(2):219- 229. doi: 10.1016/j.yex?cr.2014.04.014.

[11] Kang MJ, Chung J, Ryoo HD. CDK5 and MEKK1 mediate proapoptotic signalling following endoplasmic reticulum stress in an au?tosomal dominant retinitis pigmentosa model [J]. Nat Cell Biol, 2012, 14(4): 409-415. doi: 10.1038/ncb2447.

[12] Le Tourneau C, Faivre S, Laurence V, et al. Phase I evalua?tion of seliciclib (R- roscovitine), a novel oral cyclin- dependent ki?nase inhibitor, in patients with advanced malignancies [J]. Eur J Cancer, 2010, 46(18):3243-3250. doi: 10.1016/j.ejca.2010.08.001.

[13] Milovanceva-Popovska M, Kunter U, Ostendorf T, et al. R-rosocvi?tine (CYC202) alleviates renal cell proliferation in nephritis without aggravating podocyte injury [J]. Kidney Int, 2005, 67(4):1362-1370. doi:10.1111/j.1523-1755.2005.00213.x.

（2015-06-08收稿2015-08-24修回）

（本文編輯陸榮展）

作者單位：1河北醫科大學病理學教研室（郵編050017）；2河北醫科大學第二醫院血管外科；3河北醫科大學診斷學教研室

The role of roscovitine in tunicamycin induced podocyte injury

GAO Xiang1, 2, ZHANG Yue3, ZHANG Ai′jin1, FU Peng1, LI Jialin1, WU Jian1, LIU Wei1△
1 Department of Pathology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China; 2 Department of Vascular Surgery, the Second Hospital of Hebei Medical University, 3 Department of Diagnostics, Hebei Medical University
△Corresponding Author E-mail: lwei929@126.com

Abstract:Objective To observe the protective effects of roscovitine on the podocyte injury induced by endoplasmic reticulum stress (ERS) caused by tunicamycin. Methods The differentiated podocytes cultured at 37℃were randomly di?vided into: (1) Control group, DMSO group and tunicamycin group (TM, 1.0 μmol/L). The treatment was given for 3, 6 and 12 hours in three groups. (2) For control group, tunicamycin group, tunicamycin+roscovitine group (20, 40 μmol/L, TM+ROS), the treatment was given for 12 hours. The podocyte apoptosis was detected by flow cytometry and TUNEL method. The ex?pressions of Cdk5, GRP78, Caspase-12 and CHOP were detected by Western blot assay. Results (1) Compared with con?trol group and DMSO group, the podocyte apoptosis was increased significantly in a time dependent manner after tunicamy?cin treatment in TM group; the protein expressions of Cdk5, GRP78, Caspase-12 and CHOP were also up-regulated signifi?cantly in TM group (P < 0.05). (2) Flow cytometry and TUNEL analysis showed that tunicamycin induced apoptosis in podo?cytes, which was significantly inhibited by roscovitine in a concentration dependent manner in TM+ROS group as compared to that of TM group (P < 0.05). The protein expressions of GRP78, Caspase-12 and CHOP were also significantly decreased in a concentration dependent manner in TM+ROS group compared to those of TM group (P < 0.05). Conclusion Roscovi?tine, the inhibitor of Cdk5, can reduce the podocyte apoptosis induced by tunicamycin. The protective effects of roscovitine on podocytes can be a novel approach of treating diabetic nephropathy.

Key words:podocyte; apoptosis; Tunicamycin; Cdk5; endoplasmic reticulum stress; Roscovitine

中圖分類號：R692.6

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/59025

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81400731）；河北省自然科學基金資助項目（H2013206139，H2015206257）；河北省衛生和計劃生育委員會重點科技研究計劃項目（20130140）；河北醫科大學大學生創新性實驗計劃資助項目（201410089018）

作者簡介：高翔（1982），男，主治醫師，碩士，主要從事糖尿病血管病變研究