miRNA-7對食管癌細胞TE-1化療耐藥的影響

溫爽，楊曉煜，張敏，褚秀峰，鐘根深，姬穎華△，路平△

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miRNA-7對食管癌細胞TE-1化療耐藥的影響

溫爽1，楊曉煜2，張敏1，褚秀峰1，鐘根深3，姬穎華1△，路平1△

摘要：目的探討微小RNA-7（miRNA-7）過表達對食管癌細胞TE-1順鉑敏感性的影響及其可能機制。方法用Lipofectmin 2000法向食管癌細胞株TE-1轉染組瞬時轉染miRNA-7 mimic，向轉染對照組瞬時轉染mimic Negative Control，通過RT-PCR檢測以上2組及空白對照組的miRNA-7以及表皮生長因子受體（EGFR）mRNA表達情況。Western blot法分別檢測轉染組與轉染對照組總EGFR及細胞漿、細胞核內的EGFR蛋白表達。CCK-8檢測轉染組與轉染對照組TE-1的順鉑半數抑制濃度（IC50）。免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察轉染組與轉染對照組EGFR的表達。結果轉染組較轉染對照組及空白對照組的miRNA-7表達顯著增高，EGFR mRNA表達下降（均P＜0.001)；轉染組較轉染對照組總EGFR降低，核內EGFR增高（均P＜0.01），胞漿EGFR表達降低（P＜0.05）；CCK-8結果顯示，TE-1中miRNA-7過表達后順鉑（48 h）IC50較轉染對照組增高（P＜0.01）；免疫熒光示轉染組較轉染對照組核內EGFR增高且胞膜與胞漿EGFR表達減少。結論食管癌細胞TE-1中miRNA-7過表達可通過EGFR核轉位增多使順鉑產生耐藥性。

關鍵詞：食管腫瘤；順鉑；受體,表皮生長因子；抗藥性,腫瘤；微RNAs；核轉位；微小RNA-7

△通訊作者E-mail：sunny8441_cn@sina.com；lupingdoctor@126.com

食管癌是我國常見的惡性腫瘤，目前治療方案以手術聯合放化療為主[1]。順鉑（DDP）是晚期食管癌的一線治療藥物，但較易產生耐藥性[2]。DDP主要作用于細胞的DNA,可導致DNA損傷并誘發細胞凋亡[3]。表皮生長因子受體（EGFR）是一種具有酪氨酸激酶活性的糖蛋白，主要分布在細胞膜表面，與其配體結合發揮生物學效應。研究發現，細胞核內EGFR可通過調節DNA修復，影響腫瘤細胞對DDP和放療的治療反應，這可能是食管癌DDP耐藥的原因之一[4]。因此，抑制EGFR在理論上可恢復食管癌對DDP的敏感性。微小RNA-7（microRNA-7，miRNA-7）是miRNA家族成員之一，可直接作用于EGFR 3′-非翻譯區（UTR），抑制EGFR mRNA及其蛋白表達[5]。miRNA-7能否增強食管癌細胞對DDP敏感性尚少見相關報道。本研究旨在通過轉染技術觀察miRNA-7過表達對食管癌TE-1細胞DDP敏感性的影響，并探究其可能的機制，以期為解決食管癌DDP耐藥性提供參考。

1　材料與方法

1.1材料hsa- miRNA-7-5p mimic、mimic Negative Control(廣州銳博生物公司)；脂質體LipofectamineTM2000（Lip 2000，Invitrogen公司)；opti-MEM（杭州吉諾生物醫藥技術有限公司）；CCK-8（北京同仁化學）；EGFR Rabbit mAb（Cell Signal?ing Technology）；Tubulin、細胞漿蛋白和細胞核蛋白提取試劑盒、青霉素-鏈霉素（上海碧云天）；熒光素標記（FITC）的羊抗兔二抗(武漢博士德公司)；辣根標記的羊抗小鼠二抗、羊抗兔二抗（北京中杉金橋）；Trizol（大連寶生物生物工程有限公司）；引物合成（上海生工生物工程有限公司）；E.coli Poly(A) Polymerase試劑盒（NEB公司）；反轉錄試劑盒、常規及熒光定量PCR（RT-PCR）試劑（北京康為世紀生物工程有限公司）；DDP（齊魯制藥廠）；RPMI1640細胞培養液、胎牛血清（FBS，Hyclone）；超凈工作臺(江蘇蘇凈集團有限公司)；低溫臺式高速離心機、CO2培養箱、全波長掃描酶標儀（美國Thermo Scientific）；激光共聚焦顯微鏡（Olympus Corporation）。

1.2方法

1.2.1細胞培養人食管癌細胞株TE-1購自上海細胞庫，本實驗室長期凍存。參照文獻[6]，取對數生長期細胞進行實驗。每組均設復孔，實驗重復3次。

1.2.2細胞轉染參照文獻[7]，收集對數生長期的TE-1細胞，將細胞重懸后接種于6孔培養板和96孔板培養板中，6孔板每孔約（4～5）×105個細胞，96孔板每孔約（4～5）×103個細胞。8 h貼壁培養，當細胞密度約50%～70%時按產品使用手冊，應用Lip 2000法進行轉染。hsa-miRNA-7-5p mimic、mimic Negative Control終濃度為50 nmol/L，Lip 2000按比例配置加入。hsa- miRNA-7-5p mimic作為轉染組，mimic Neg?ative Control作為轉染對照組，單純Lip 2000作空白對照組。轉染后分別于24、48、72 h收集細胞，取轉染變化最明顯的時點進行各組間統計比較。

1.2.3相關引物序列和RT-PCR miRNA-7引物序列:5′-CGGTGGAAGACTAGTGATTTTGTTG-3′。EGFR引物上游: 5′-AACCTTCTGGAGGGTGAGCC- 3′；下游:5′-GTTGTCTG?GTCCCCGTCCTG-3′。GAPDH上游：5′-GATCATCAGCAAT?GCCTCCTG-3′；下游：5′-CATGGACTGTGGTCATGAGTC-3′。細胞轉染后，Trizol提取細胞總RNA后進行Poly(A)加尾，按照RT-PCR試劑盒說明書逆轉錄成cDNA。RT-PCR反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性15 s；60℃1 min(采集SYBR熒光信號)，60～95℃熔解曲線，40個循環。PCR反應結束后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測各個基因PCR結果。通過RT-PCR檢測細胞樣品中目的基因和內參基因的表達量，以GAPDH表達水平作為內參，通過2－ΔΔct法比較3組間miRNA-7和EGFR mRNA相對含量。

1.2.4Western blot應用RIPA裂解液，添加苯甲基磺酰氟(PMSF，1 mmol/L)提取細胞總蛋白、漿蛋白及核蛋白。蛋白濃度定量采用BCA法。樣品應用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠分離，轉移至硝酸纖維素膜，5%BSA中封閉，分別應用EGFR抗體（1∶1 000）或內參抗體Tubulin（1∶1 000）抗體孵育，4℃過夜。室溫下，采用辣根過氧化物酶標記的二抗搖床孵育。采用ECL化學發光法使條帶顯影，用成像軟件掃描膠片并保存圖片，用Image J圖像分析軟件分別測定轉染組與轉染對照組（經基因測定與觀察，空白對照組對細胞基本無影響,與轉染對照組無差異，故舍棄空白對照組）條帶的光密度（OD）值。

1.2.5CCK-8法檢測轉染miRNA-7對TE-1 DDP敏感性的影響將TE-1接種至96孔板，設轉染對照（NC）組與轉染組，每組中均設定調零組和實驗（0、1、2、3、4）組，每組5個復孔，實驗組每孔100 μL細胞懸液，調零組加等量培養基。細胞貼壁后，實驗組用Lip 2000法按說明書轉染，48 h后加DDP處理。轉染組中0～4組梯度DDP濃度分別為0、16.66、33.33、66.66及133.32 μmol/L，轉染NC組中0～4組梯度DDP濃度分別為0、8.33、16.66、33.33及66.66 μmol/L。藥物分別作用24、48及72 h后，按照CCK-8試劑盒說明書操作，繼續孵育4 h后于波長450 nm處測OD值。以空白對照組細胞抑制率為100%，計算不同濃度藥物對細胞增殖的抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(1-藥物組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。以藥物濃度為橫軸，細胞抑制率為縱軸，繪制藥物濃度-細胞抑制率曲線。實驗重復3次，比較2組DDP的半數抑制濃度（IC50）。

1.2.6免疫熒光法觀察EGFR核內外分布參照文獻[8]，取轉染48 h后的TE-1細胞爬片，固定，0.1%TrionX-100透膜，10%BSA封閉，轉染組及轉染NC組一抗孵育（EGFR濃度1∶50，5%BSA稀釋）4℃過夜，二抗孵育（FITC標記抗體，1∶50，1%BSA稀釋），DAPI染核后緩沖甘油封片，共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3統計學方法采用SPSS 18.0統計軟件分析。符合正態分布的計量數據以均數±標準差（x ±s）表示，2組間均數比較用t檢驗，多組間均數的比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t法。P < 0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1過表達miRNA-7對EGFR mRNA及蛋白的影響48 h轉染最明顯，空白對照與轉染對照組的miRNA-7、EGFR mRNA基因表達差異均無統計學意義；轉染組miRNA-7較轉染對照組及空白對照組明顯增高，EGFR mRNA較轉染對照組及空白對照組明顯降低（均P < 0.001），見表1。Western blot結果示轉染組（1.54±0.13）較轉染對照組（2.94±0.10）總EGFR明顯下降（t=30.98，P＜0.01），見圖1。

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Tab.1 The differences of the miRNA-7 and EGFR mRNA gene in three groups表1　不同處理組miRNA-7、EGFR mRNA基因表達的差異(n=3，2-ΔΔCt值，±s)

Tab.1 The differences of the miRNA-7 and EGFR mRNA gene in three groups表1　不同處理組miRNA-7、EGFR mRNA基因表達的差異(n=3，2-ΔΔCt值，±s)

＊＊P < 0.01，a與（1）比較，b與（2）比較，均P < 0.001

組別空白對照組（1）轉染對照組（2）轉染組（3）F miRNA-7基因0.147 108±0.001 433 0.141 041±0.016 819 405.153 300±6.796 850ab10 650.00＊＊EGFR mRNA基因0.002 723±0.000 188 0.002 207±0.000 355 0.000 909±0.000 019ab48.77＊＊

Fig. 1 Effects of the over-expressed miRNA-7 on expression of total EGFR in TE-1 cells圖1　miRNA-7過表達對TE-1中總EGFR表達的影響

2.2CCK-8法檢測miRNA-7過表達對TE-1 DDP敏感性的影響轉染組DDP IC50值顯著高于轉染對照組[(30.38±0.98)μmol/L vs (11.47±0.61)μmol/L，t= 38.67，P < 0.01]，見圖2。

Fig. 2 Effects of the over-expressed miRNA-7 on the sensitivity of cisplatin in TE-1 cells圖2　miRNA-7過表達后TE-1對DDP的敏感性

2.3轉染后2組核蛋白及漿蛋白中EGFR的表達轉染48 h后，Western blot結果示轉染組胞漿中EGFR表達低于轉染對照組[(1.10±0.05) vs (1.60± 0.08)，t=6.68，P < 0.05]。胞核中EGFR表達明顯增高[(1.95±0.13) vs (0.95±0.03)，t=17.14，P < 0.01]，見圖3。

Fig. 3 Effects of the over-expressed miRNA-7 on cytoplasm expression of EGFR and nucleus expression of EGFR in TE-1 cells圖3　miRNA-7過表達對TE-1細胞漿EGFR、細胞核EGFR表達的影響

2.42組TE-1細胞中EGFR的核內外分布情況EGFR免疫熒光用綠色標記。轉染對照組熒光定位于胞膜和胞漿中，且細胞100%陽性表達；轉染組EGFR核內高表達，胞膜和胞漿表達減少，細胞核95%陽性表達，見圖4。

3　討論

DDP通過使腫瘤細胞形成DNA加合物，造成DNA損傷，從而抑制腫瘤細胞DNA復制，使細胞分裂和再生停止，最終殺滅腫瘤細胞。然而，DDP耐藥的產生，嚴重地影響了患者的療效和生存質量[9]。目前DDP的耐藥機制主要表現為細胞的DNA修復能力增強或者耐受DNA損傷能力增強。Wang等[10]和Huo等[11]發現，核內EGFR能夠直接參與DNA損傷的修復和DNA的復制。當發生DNA損傷和氧化性應激后，核內EGFR與DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PK)相互作用，并且通過與非配體依賴的途徑使DNA修復，對射線等引起的DNA損傷產生抵抗效應[4,12]。EGFR單抗Erbitux可阻斷EGFR核轉移，降低DNA-PK的活性，增強殘基DNA損害，進而降低放療或化療后腫瘤細胞的存活率[13]。本課題組在前期研究中亦發現，DDP可誘導食管癌EC9706細胞EGFR向核內移位[14]。因此，靶向抑制核內EGFR有可能逆轉食管癌的DDP耐藥。

miRNA -7在多種腫瘤中低表達，其能夠通過抑制胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)、EGFR、ACK1等基因的表達，抑制胃癌、肺癌、卵巢癌、惡性神經鞘瘤等多種惡性腫瘤的侵襲轉移，起到抑癌基因的功能[15]。本研究結果顯示，過表達miRNA-7可顯著降低EGFR mRNA和總EGFR蛋白表達。然而，CCK-8增殖實驗結果表明，過表達miRNA-7卻增強了TE-1對DDP的耐藥性。為揭示miRNA-7增強TE-1對DDP的耐藥性的可能機制，本研究應用Western blot和免疫熒光等方法觀察miRNA-7對EGFR核內外分布的影響。Western blot結果顯示，過表達miRNA-7后胞漿中EGFR降低，但胞核中EGFR表達明顯增高。免疫熒光結果同樣顯示，過表達miRNA-7使細胞膜和胞漿中EGFR表達明顯減少，而增加了EGFR核內表達。這提示在食管癌TE-1細胞中，miRNA-7有可能增加了EGFR核轉位，從而誘導了DDP耐藥。核內EGFR能夠誘導DDP耐藥，而miRNA-7可抑制EGFR表達已經成為共識。因此，在實驗進行前期，筆者推測miRNA-7過表達有可能使食管癌細胞對DDP增敏。Pogribny 等[16]研究顯示，miRNA-7和miR-345在乳腺癌DDP耐藥細胞中表達均下調，當轉染miRNA-7和miR-345后，乳腺癌DDP耐藥細胞可通過降低多重耐藥相關蛋白1（MRP1）使細胞DDP敏感性增強。但本研究結果與前期預期及Pogribny等研究存在差異。這提示miRNA-7在不同腫瘤中的作用可能存在抑癌或促癌兩面性，且具有主導信號通路的差異性。在食管癌細胞TE-1中，miRNA-7過表達使EGFR核轉位的通路更具主導地位，促使DDP耐藥，或者可能有其他的通路影響DDP耐藥。

綜上所述，在腫瘤的發生與發展過程中，miRNA扮演癌基因或抑癌基因的角色，在不同腫瘤中可能扮演的角色不同。本研究表明，食管癌細胞TE-1 中miRNA-7過表達可通過EGFR發生核轉位，從而使DDP產生耐藥，但具體機制有待進一步的研究。

（圖4見插頁）

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（2015-05-14收稿2015-08-07修回）

（本文編輯陸榮展）

作者單位：1新鄉醫學院第一附屬醫院腫瘤科(郵編453100)；2新鄉醫學院病理教研室；3新鄉醫學院第一附屬醫院神經病研究所

The effect of miRNA-7 on chemoresistance in esophageal cancer cell TE-1

WEN Shuang1，YANG Xiaoyu2，ZHANG Min1，CHU Xiufeng1，ZHONG Genshen3，JI Yinghua1△，LU Ping1△
1 Department of Oncology, the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Henan 453100, China; 2 Department of Pathology, Xinxiang Medical University; 3 Research Institution of Neurology, the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College
△Corresponding Author E-mail:sunny8441_cn@sina.com；lupingdoctor@126.com

Abstract：Objective To explore the impacts of over-expression of microRNA-7 (miRNA-7) on the sensitivity of cis?platin in esophageal carcinoma cell line TE-1, and the possible mechanism thereof. Methods Lipofectmin 2000 method was used to transient transfect with miRNA-7 mimic into esophageal cancer cell line TE-1, which was taken as transfection group, mimic negative control was taken as transfection conrtol group. The expressions of miRNA-7 and epidermal growth factor receptor (EGFR) mRNA were detected by RT-PCR in the above two groups and normal control group. The total EGFR and EGFR in cytoplasmic and nucleus were detected with Western blot assay in transfection group and transfection control group. CCK-8 was used to detect IC50of cisplatin in transfection group and transfection control group. The expression of EGFR was observed with immunofluorescence confocal microscope in two groups. Results The miRNA-7 expression was signifi?cantly increased in transfection group than that of transfection conrtol group and control group. The expression of EGFR mRNA was significantly reduced in transfection group (P＜0.001). The total EGFR was significantly decreased in transfec?tion group than that of transfection conrtol group. The level of nuclear EGFR was significantly increased (P＜0.01)，and cyto?plasm EGFR expression was significantly decreased in transfection group than that of transfection control group (P＜0.05). CCK-8 results showed that after the over expression of miRNA-7 in TE-1, the IC50of cisplatin (48 h) increased in transfec?tion group than that of control group (P＜0.01). Immunofluorescence results showed that EGFG in nuclear was higher in transfection group than that of transfection control group but its expressions reduced in cell membrane and cytoplasm. Con?clusionThe over-expressed miRNA-7 in esophageal cancer cells TE-1 can reduce cisplatin sensitivity by the increased EGFR in nuclear translocation.

Key words：esophageal neoplasms; cisplatin; receptor, epidermal growth factor; drug resistance, neoplasm; microRNAs; nuclear translocation; miRNA-7

中圖分類號：R735.1，R979.1

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/58919

基金項目：新鄉醫學院科研項目培育基金資助項目（2013QN127）

作者簡介：溫爽（1989），女，碩士在讀，主要從事惡性腫瘤的綜合治療研究