亞低溫聯合載神經干細胞的纖維蛋白支架對顱腦創傷的修復作用

廖余平，陳翀，李曉紅，王景景，陳以勝，張賽，孫洪濤△

?

亞低溫聯合載神經干細胞的纖維蛋白支架對顱腦創傷的修復作用

廖余平1,2，陳翀1，李曉紅1，王景景1，陳以勝1，張賽1，孫洪濤1△

摘要：目的研究大鼠顱腦創傷（TBI）后原位移植神經干細胞（NSCs）治療的可能性，探討載有NSCs的纖維蛋白支架及與亞低溫（MHT）聯合對TBI的治療作用。方法從孕14 d SD大鼠皮質組織中分離NSCs，與纖維蛋白支架共培養，應用掃描電鏡觀察支架及NSCs的形態，并通過免疫熒光檢測細胞類型。將48只雄性SD大鼠隨機分成TBI組（A組）、TBI+NSC組（B組）、TBI+MHT組（C組）、TBI+NSC+MHT組（D組），每組12只。A組通過液壓損傷儀行TBI造模；B組TBI后接受NSCs移植治療；C組TBI后接受MHT治療；D組TBI后接受NSCs與MHT聯合治療。分別在第14、28天通過神經功能缺陷評分（mNSS）和水迷宮實驗對大鼠進行神經功能評價；28 d后取腦組織切片，行細胞免疫熒光檢測，觀察移植后的NSCs在體內分化情況。結果電鏡掃描顯示，NSCs與纖維蛋白支架共培養3 d后形態無明顯改變；免疫熒光提示NSCs特異性標志物Nestin陽性表達，表明神經干細胞在纖維蛋白支架上存活；D組大鼠的mNSS在第14天和第28天均低于A、B、C各組；水迷宮結果顯示，D組大鼠逃避潛伏期短于A、B、C各組；D組28 d后腦組織取材可追蹤到BrdU標記的神經干細胞分化為了神經元。結論纖維蛋白支架與NSCs生物相容性良好，具有可降解性。亞低溫與載NSCs的纖維蛋白支架對大鼠TBI后的神經功能修復具有協同作用。

關鍵詞：顱腦損傷；神經干細胞；纖維蛋白支架；亞低溫

△通訊作者E-mail：chenmo333@163.com

大量的基礎和臨床研究表明，神經干細胞（neu?ral stem cells，NSCs）移植治療顱腦創傷（traumatic brain injury，TBI）的效果不夠理想，其原因主要與NSCs的低存活率有關[1]。移植干細胞的大量死亡主要與TBI局部缺血、缺氧、炎癥、水腫的微環境有關[2]。移植干細胞在目標部位存活是干細胞發揮作用的前提，而影響干細胞行為的決定性因素主要是局部的微環境。前期的研究通過皮質損傷后直接局部移植NSCs發現，移植細胞黏附、遷移到損傷區的比例非常低[3-4]，主要是缺乏支撐移植細胞存活的三維細胞外基質結構，細胞移植后大部分被遷移丟失。本實驗采用纖維蛋白支架模擬細胞外基質結構，聯合亞低溫治療（mild hypothermia treatment，MHT）對TBI大鼠進行干預，探討其對TBI的治療效果。

1　材料與方法

1.1材料孕14 d SD大鼠胎鼠和清潔級260～300 g SD大鼠（購自解放軍軍事醫學科學院）；纖維蛋白原、凝血酶、抑肽酶（Sigma，美國）；B27、成纖維細胞生長因子（Fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、BrdU（Sigma，美國）；DMEM培養基（Gibco，美國）；小鼠抗BrdU抗體（Abcam，英國）；兔抗NeuN抗體、FITC標記的山羊抗小鼠IgG二抗、FITC標記的山羊抗兔IgG二抗（Life technology，美國）。

1.2方法

1.2.1NSCs分離與培養孕14 d的SD大鼠胎鼠采用6%水合氯醛（36 mg/kg）進行腹腔麻醉，75%乙醇全身消毒，剖腹取胎鼠，取腦，剪碎吹打，加入全培養基[DMEM/F12、20 μg/L EGF、20 μg/L bFGF、1% N2（N-2supplement），2% B274mmol/L谷氨酰胺]，于37℃、5%CO2培養箱中培養。培養3～ 4 d離心、棄去上清液，5～7 d后用吸管吹打NSCs球（即形成的細胞克隆）制成單細胞懸液后繼續傳代。用10 μmol/L的BrdU標記48 h備用。

1.2.2纖維蛋白支架的制備將纖維蛋白原溶解在生理鹽水中，配制成40 g/L的纖維蛋白原溶液（含50 U/mL的抑肽酶）。將凝血酶溶解在40 mmol/L CaCl2溶液中，配制濃度為40 U/mL的凝血酶溶液。將纖維蛋白溶液和凝血酶溶液等體積混合后，置入37℃恒溫箱中，充分孵育10 min，待纖維蛋白完全凝膠后，檢測其性能。

1.2.3纖維蛋白支架的微觀結構將制備的纖維蛋白凝膠樣品采用乙醇溶液進行脫水，加入丙酮和醋酸異戊酯進行置換，最后采用CO2臨界點干燥法進行干燥后噴金，在掃描電鏡下觀察纖維蛋白支架的形態。

1.2.4纖維蛋白支架與NSCs的生物相容性1×106個NSCs種植于上述制備的纖維蛋白支架上，隔天半量換液。掃描電鏡標本制備，48 h、96 h后分別以2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脫水，臨界點冷凍干燥，噴金，掃描電鏡觀察細胞的形態和分布。免疫熒光標本制備，72 h后用4%多聚甲醛固定，10μm冰凍切片，行Nestin免疫熒光染色，觀察細胞在支架內的生長情況。

1.2.5重型腦損傷模型的制作將SD大鼠（n=48）采用抽簽法隨機分成4組，每組12只。TBI組（A組）大鼠行顱腦液壓沖擊損傷；TBI+NSC組（B組）經顱腦液壓沖擊損傷后給予NSC混合支架治療；TBI+MHT組（C組）經顱腦液壓沖擊損傷后給予亞低溫治療；TBI+NSC+MHT組（D組）顱腦液壓沖擊損傷后給予NSC混合支架及亞低溫治療。稱質量，6%水合氯醛（36 mg/kg）麻醉，固定于立體定向儀，頭皮正中切開，暴露顱骨，以前囟后3.8 mm、中線右側2.5 mm為中心，開直徑4.0 mm圓形骨窗；用增強型牙科磷酸鋅水門汀將打擊管固定于顱骨上，在管內充滿生理鹽水；連接液壓沖擊腦損傷儀的打擊口，調整沖擊壓為243.18 kPa，平均時程為20 ms。TBI之后、骨蠟止血，大鼠于溫暖、增氧恢復室、含食物及水的環境下進行飼養。

1.2.6NSCs移植TBI后即刻行混合支架移植，溶解在40 g/L纖維蛋白原中的1×106個NSCs，與溶解在40 mmol/L Ca?Cl2的40 U/mL凝血酶等體積混合（含抑肽酶50 U/mL）,移植入損傷近緣，分4個位點注射，每個位點5 μL。

1.2.7亞低溫聯合治療在進行細胞移植后即刻接受亞低溫治療。用小動物亞低溫治療儀在30 min內將全身降溫至肛溫33℃，維持6 h，然后復溫至37℃，復溫速度為0.4℃/h。

1.2.8神經功能缺陷評分與Morris水迷宮實驗TBI后0、14、28 d分別行單盲神經運動功能檢測。在移植后第14天及第28天通過神經功能缺陷評分（modified neurological se?verity score，mNSS）進行單盲神經功能評分。評分由運動（肌張力、異常活動）、感覺（視覺、觸覺、本體感覺）、反射、平衡試驗組成，評分在0～18分，正常為0分，最大神經功能缺失為18分。Morris水迷宮實驗測試大鼠的學習記憶能力，大鼠TBI前3 d連續進行水迷宮訓練，TBI后記錄大鼠從入水到找到平臺所用時間，即逃避潛伏期。

1.3統計學方法采用SPSS 19.0進行統計處理。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用LSD-t檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1纖維蛋白支架與NSCs的生物相容性對凝固后的纖維蛋白支架及混合支架行掃描電鏡觀察，單純纖維蛋白支架在掃描電鏡下的孔隙結構，見圖1a；共培養支架孔隙之間有細胞形態，與支架黏附緊密，見圖1b。共培養支架免疫熒光結果顯示，Nestin呈持續陽性表達，見圖2。共培養支架免疫熒光以及掃描電鏡觀察提示，纖維蛋白支架是構建可降解、生物相容性好的三維支架材料，能為NSCs提供適宜的細胞外基質，起到暫時固定NSCs的作用。

Fig.1 Observation of fibrin scaffold and mixed fibrin scaffold by SEM圖1　纖維蛋白支架與混合支架的掃描電鏡觀察

2.2NSCs存活情況結果顯示，D組移植的NSCs能夠存活，并分化為神經元，見圖3。

2.3NSCs移植與亞低溫對TBI大鼠mNSS的影響TBI后14 d及28 d，B組或C組處理與A組相比都能促進mNSS的降低（P < 0.05）；D組的mNSS低于B、C和A組（P < 0.01）；B組與C組mNSS比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

Tab. 1 Comparison of mNSS score after TBI between four groups表1　TBI后各組mNSS評分比較（n=12，分，±s）

Tab. 1 Comparison of mNSS score after TBI between four groups表1　TBI后各組mNSS評分比較（n=12，分，±s）

＊＊P < 0.01；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，P < 0.05；表2同

組別A組B組C組D組F TBI后14 d 5.42±1.44 4.17±1.03a4.25±1.22a2.75±1.06abc9.973＊＊TBI后28 d 3.75±0.87 2.83±0.94a2.92±0.90a1.42±0.90abc13.838＊＊

2.4NSCs與亞低溫對TBI大鼠逃避潛伏期的影響TBI后14 d及28 d，B組或C組與A組相比都能促進逃避潛伏期的縮短（P < 0.05）；D組的逃避潛伏期低于B、C和A組（P < 0.01）；B組與C組逃避潛伏期差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

Tab. 2 Comparison of escape latency after TBI between four groups表2　各組Morris水迷宮試驗逃避潛伏期比較（n=12，s，±s）

Tab. 2 Comparison of escape latency after TBI between four groups表2　各組Morris水迷宮試驗逃避潛伏期比較（n=12，s，±s）

組別A組B組C組D組F TBI后14 d 73.00±16.87 55.92±13.64a58.75±21.51a44.75±17.01abc8.473＊＊TBI后28 d 63.25±16.41 49.75±12.14a48.83±16.43a33.83±11.51abc7.878＊＊

3　討論

筆者前期的研究通過皮質損傷后直接局部移植NSCs發現，移植細胞黏附、遷移到損傷區的比例非常低，很大部分原因是缺乏支撐移植細胞存活的三維的細胞外基質結構，細胞移植后大部分隨體液丟失[5]。Karlsson等[1]研究發現，當移植組織植入大鼠后保持亞低溫（32～33℃）能改善移植物的存活。聯合亞低溫治療被廣泛用于TBI治療研究[6-7]。亞低溫對TBI的神經保護作用強調在TBI后的早期應用[8]，本實驗TBI后的即刻將實驗大鼠進行亞低溫治療。實驗鼠與NSCs來源為同種系，基因型相同，NSCs移植到大鼠體內后不產生免疫排斥反應，因此，實驗過程沒有應用免疫抑制藥物。本次研究首次采用載有NSCs的纖維蛋白支架用于TBI的局部治療，采用液壓損傷儀行TBI造模，清除血腫后局部注射混合支架。研究發現與A組相比，B、C、D組的神經功能與認知能力得到改善。D組能夠追蹤到BrdU標記的NSCs。進一步的分析發現，當纖維蛋白混合支架聯合亞低溫治療時具有最大的保護作用。本研究結果顯示亞低溫能促進移植NSCs的存活，亞低溫與干細胞對大鼠神經功能的保護優于其各自的單獨作用。

3.1亞低溫對急性顱腦創傷的神經保護作用低溫狀態下腦代謝下降，腦組織對氧氣及葡萄糖的消耗減少，使腦組織易于維持氧的供需平衡，并可以減少和抑制氧自由基及興奮性神經遞質的生成與釋放[9]，亞低溫還可以通過抑制某些炎性介質（如花生四烯酸等）的生成及釋放[10]，改善腦缺血后血腦屏障的通透性，從而可以減輕血腦屏障的破壞和血管源性腦水腫的發生，改善微環境，一方面起到神經保護作用，另一方面可能起到促進移植NSCs存活的作用。

3.2纖維蛋白支架的優點在組織工程技術領域，三維的支架結構用于調節以及引導細胞生長并促進組織再生，支架需具有良好生物相容性、能進行生物降解、促進細胞以及生物材料相互作用。一些天然的生物材料如纖維蛋白支架能為宿主提供一個類似的細胞外基質結構。自體纖維蛋白支架因其低纖維蛋白原濃度、不引起炎癥反應，更適合細胞的生長[11]。采用纖維蛋白支架模擬NSCs的細胞外基質結構，能為移植NSCs提供一暫時的立體生長環境，防止其隨體液丟失。

3.3神經干細胞的作用機制研究表明，NSCs移植保護神經系統免受炎癥損傷通過多重機制，不單是直接的細胞替代，NSCs能到達靶器官，并分化成合適的細胞系[12]。移植細胞可能在解剖上重建損傷的大腦，移植細胞與宿主細胞形成突觸連接，外生的細胞進入顱內可以產生神經營養因子和生長因子，移植細胞可以促進內源性細胞產生神經營養因子和生長因子。內源性細胞和外源性細胞是動態變化的，對微環境都非常敏感，外源性細胞具有向損傷處遷移的特性[13]。

亞低溫對TBI具有神經保護作用，細胞移植也廣泛用于中樞神經損傷的修復研究，本研究將亞低溫與神經干細胞聯合，發現亞低溫能促進移植NSCs的存活，兩者聯合對神經功能的修復具有協同作用，但其協同的機制以及潛在的應用價值有待進一步研究。

（圖2、3見插頁）

參考文獻

[1] Karlsson J, Emg?rd M, Gid? G, et al. Increased survival of embryon?ic nigral neurons when grafted to hypothermic rats[J]. Neuroreport, 2000, 11(8): 1665-1668.

[2] Yu Y，Zhang LY,Yan H. Research progress of early rehabilitation therapy on severe traumaticbrain injury[J]. Chin J Contemp Neurol Neurosurg, 2014, 14(6):548-551. [于洋,張琳瑛,閆華.重型顱腦創傷早期康復治療研究進展[J].中國現代神經疾病雜志, 2014, 14(6)：548-551]. doi:10.3969/j.issn.1672-6731.2014.06.017.

[3] Cromer Berman SM, Kshitiz, Wang CJ, et al. Cell motility of neural stem cells is reduced after SPIO-labeling, which is mitigated after exocytosis [J]. Magn Reson Med, 2013, 69(1): 255-262. doi: 10.1002/mrm.24216.

[4] Zhang S, Liu XZ, Sun HT, et al. Effect of brain-derived neurotrophic factor on environmental nutrition and neural differentiation of the transplanted stem cells under hypothermia[J].Chin J Trauma, 2011, 27 (1):68-71.[張賽,劉曉智,孫洪濤，等.腦源性神經營養因子對亞低溫處理后移植干細胞的存活及分化的影響[J].中華創傷雜志, 2011, 27(1):68-71]. doi:10.3760/cma.j.issn.1001-8050.2011.01.022.

[5] Lu D, Mahmood A, Qu C, et al. Collagen scaffolds populated with human marrow stromal cells reduce lesion volume and improve functional outcome after traumatic brain injury[J]. Neurosurgery, 2007, 61(3): 596. doi: 10.1227/01.NEU.0000290908.38438.B2.

[6] McIntyre LA, Fergusson DA, Hébert PC, et al. Prolonged therapeu?tic hypothermia after traumatic brain injury in adults: a systematic review[J]. JAMA, 2003, 289(22): 2992-2999.

[7] Hu QL, Zhang M, Tu Y, et al. Efficacy analysis of early mild hypo?thermia combined with post-hyperbaric oxygen treatment in severe traumatic brain injury[J]. Tianjin Med J, 2012, 40(8): 760-762. [胡群亮，張民，涂悅，等.早期亞低溫結合后期高壓氧治療重度顱腦創傷的療效分析[J].天津醫藥, 2012, 40(8): 760-762]. doi: 10.3969/j.issn.0253-9896.2012.08.003.

[8] Jiang JY. Clinical study of mild hypothermia treatment for severe traumatic brain injury[J]. J Neurotrauma, 2009, 26(3):399-406. doi: 10.1089/neu.2008.0525.

[9] Kil HY, Zhang J, Piantadosi CA. Brain temperature alters hydroxyl radical production during cerebral ischemia/reperfusion in rats[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 1996, 16(1): 100-106.

[10] Wang Q, Huang HL, Liu R, et al. Effect of mild hypothermia treat?ment on respiratory chain of mitochondrion following traumatic brain injury in SD rats[J]. Tianjin Med J, 2008,36(7):524-526. [王琴，黃慧玲，劉瑞，等.亞低溫對急性顱腦創傷大鼠線粒體呼吸鏈酶活性的影響[J].天津醫藥, 2008,36(7):524-526]. doi:10.3969/j. issn.0253-9896.2008.07.015.

[11] de la Puente P, Lude?a D. Cell culture in autologous fibrin scaffolds for applications in tissue engineering[J]. Expcell Res, 2014, 322(1): 1-11.doi: 10.1016/j.yexcr.2013.12.017.

[12] Sharp KG, Yee KM, Steward O. A re-assessment of long distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury[J]. Exp Neurol, 2014, 257(7): 186-204. doi: 10.1016/j.exp?neurol.2014.04.008.

[13] Blaya MO, Tsoulfas P, Bramlett HM, et al. Neural progenitor cell transplantation promotes neuroprotection, enhances hippocampal neurogenesis, and improves cognitive outcomes after traumatic brain injury[J]. Experimental neurology, 2015, 264(2): 67-81. doi: 10.1016/j.expneurol.2014.11.014.

（2015-05-05收稿2015-09-25修回）

（本文編輯李鵬）

作者單位：1腦創傷與神經疾病研究所，武警后勤學院附屬醫院腦科醫院，天津市神經創傷修復重點實驗室（郵編300162）；2遼寧醫學院，武警后勤學院附屬醫院研究生培養基地

Experimental study of combination of mild hypothermia and fibrin scaffold carrying neural stem cells on repairing traumatic brain injury

LIAO Yuping1，2, CHEN Chong1, LI Xiaohong1, WANG Jingjing1, CHEN Yisheng1, ZHANG Sai1, SUN Hongtao1△
1 Institute of Traumatic Brain Injury and Neurology, Brain Hospital of Affiliated Hospital of Logistics College of Chinese People′s Armed Police Forces, Tianjin Key Labrotary of Neurotrauma Repair, Tianjin 300162, China;
2 Liaoning Medical University, Postgraduate Training Base of Affiliated Hospital of the Logistics University of CAPF
△Corresponding Author E-mail：chenmo333@163.com

Abstract：Objective To investigate the possibility of therapy method in orthotropic transplant fibrin scaffold mixedbook=182,ebook=59neural stem cells (NSCs) after traumatic brain injury (TBI), and combined effects of that fibrin scaffold with mild hypothermia (MHT) on TBI in rats. Methods Neural stem cells were separated from E14 Sprague-Dawley rats, and were co-cultured with fibrin scaffold. Scanning electron microscope was used for observing neural stem cell surface morphology in fibrin scaf?fold, and immunofluorescent staining was introduced for detecting cell types. Forty-eight male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: TBI group (A), TBI+NSC group (B), TBI+MHT group (C) and TBI+NSC+MHT group (D). TBI model was built with fluid percussion device in group A. Group B was treated with fibrin scaffold carrying neural stem cells after TBI. Group C was treated with MHT for 6 hours after TBI. Fibrin scaffold mixed BrdU labeled neural stem cells were co-transplanted into cortex damage area of group D and mild hypothermia was given for 6 hours. mNSS (modified neuro?logical severity score) and Morris water maze were examined to evaluate the neurologic function at 14 and 28 days after TBI. The rats were sacrificed at 28 days for brain slices. Immunofluorescent staining was used to examine the migration and differ?ention of NSCs in vivo. Results No obvious morphology changes were observed in NSCs, which were co-cultured in fibrin scaffold. The specific marker Nestin was expressed in detected NSCs by immunofluorescence, which indicated that NSCs were still alive in the co-coture fibrin scaffold. The mNSS scores were significantly lower in group D than those of groupA, B and C at day-14 and day-28 (P < 0.05). Results of Morris water maze showed that the escape latency was significantly short?er in group D than that of group A, B and C (P < 0.05). BrdU labled NSCs was found differentiated into neurons in group D at day 28. ConclusionFibrin scaffold and NSCs have a good biocompatibility and biodegradablity. MHT and fibrin scaffold jointed NSCs improve neurologic function in rat TBI model with the synergistic reaction.

Key words：traumatic brain injury；neural stem cells；fibrin scaffold；mildhypothermia

中圖分類號：R651.15

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/58859

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81471275，81341113，81271392，81401067）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃項目（14JCQN?JC10200）

作者簡介：廖余平（1989），男，碩士研究生，主要從事中樞神經創傷修復研究