心功能不全合并糖尿病大鼠模型的建立與評價

李田樂，李彤，胡曉旻，楊帆，汪麗紅，楊玲

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心功能不全合并糖尿病大鼠模型的建立與評價

李田樂1，李彤2△，胡曉旻2，楊帆2，汪麗紅3，楊玲2

摘要:目的制備一種高穩(wěn)定性心功能不全合并糖尿病大鼠模型，以期方便于臨床和實驗室研究。方法取清潔級雄級Wistar大鼠45只，隨機分為3組，A組（正常組）10只，B組（腹主動脈縮窄組）10只，C組（腹主動脈縮窄合并糖尿病組）25只。首先對B、C組大鼠采用腹主動脈縮窄的方法構(gòu)建心功能不全模型，縮窄2個月后，將C組大鼠隨機分為5個亞組，C1～5，分別采用單次腹腔注射40、45、50、55、60 mg/kg鏈脲佐菌素（STZ）的方法誘導心功能不全合并糖尿病大鼠模型。實驗過程中動態(tài)觀察大鼠一般狀況及體質(zhì)量改變，監(jiān)測STZ注射后72 h、4周大鼠血糖水平，并于STZ注射后1個月對各組大鼠進行心臟超聲及心肌病理改變評價。結(jié)果對比不同劑量，STZ為45 mg/kg時，構(gòu)建模型穩(wěn)定性高且成模大鼠一般狀況、血糖水平、心臟超聲、心肌組織鏡下形態(tài)學較正常組發(fā)生明顯變化，符合心功能不全合并糖尿病改變。結(jié)論采用腹主動脈縮窄2個月后腹腔單次注射45 mg/kg STZ的方法誘導心功能不全合并糖尿病動物模型，方法簡便可靠，穩(wěn)定性高。

關(guān)鍵詞：心功能不全；糖尿病，實驗性；腹主動脈縮窄；疾病模型,動物；大鼠, Wistar

△通訊作者E-mail:litong_3zx@sina.com

心功能不全是由于各種原因所致的初始心肌損傷引起的心肌結(jié)構(gòu)和功能的變化，從而導致心臟泵血功能低下，最終發(fā)生心力衰竭，這個過程通常經(jīng)歷一個心肌肥厚、心臟重塑、心功能從代償?shù)绞Т鷥數(shù)难葑儭Ｌ悄虿t是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，臨床稱之為冠心病的等危癥。最新研究顯示，糖尿病患者心力衰竭發(fā)生率約為14.1%[1]，心衰患者糖尿病發(fā)病率更是高于普通人群[2]，然而其內(nèi)在機制卻有待于進一步闡明。隨著循證醫(yī)學的不斷發(fā)展和人體試驗倫理道德的諸方面約束，疾病發(fā)生、發(fā)展機制的研究在某種程度上更加依賴于動物實驗。本研究旨在構(gòu)建高穩(wěn)定性心功能不全合并糖尿病大鼠模型，為后期臨床和實驗室疾病發(fā)生機制、藥物治療的研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料健康清潔級雄性Wistar大鼠45只，2月齡，體質(zhì)量（190±15）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。所有大鼠飼養(yǎng)于天津市第三中心醫(yī)院動物實驗中心，室溫20～23℃，相對濕度55%～70%，自由飲食，分籠飼養(yǎng)。所有操作程序嚴格遵守美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）的實驗動物飼養(yǎng)和使用手冊。鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司），-20℃凍存，檸檬酸、檸檬酸鈉（國產(chǎn)分析純試劑），血糖試紙盒（江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司），GIQ400CL彩色超聲心動儀，9 MHz探頭（GE medical system，美國）。

1.2方法

1.2.1動物分組大鼠按隨機數(shù)字表法分為3組：正常組（A組）10只，腹主動脈縮窄組（B組）10只，腹主動脈縮窄合并糖尿病組（C組）25只。

1.2.2B組建模參照Ma等[3]的方法，大鼠適應性喂養(yǎng)1周，術(shù)前禁食12 h，3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，四肢固定、脫毛，常規(guī)碘伏消毒，分層打開腹腔，在左腎上暴露腹主動脈并在雙腎動脈上方鈍性分離腹主動脈，狗頭夾夾閉腹主動脈，缺血預適應3次，時間分別為15、30、60 s，之后將7號注射針頭去尖后平行置于動脈外壁，用4號手術(shù)絲線將二者一起扎緊后將針頭迅速移去，覆蓋腸管，1 min后觀察腹主動脈管腔環(huán)形縮窄程度，臟器回位、關(guān)腹，用2 mL注射器抽氣并注入4萬單位抗生素，術(shù)后復溫，禁食水24 h后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.3C組建模首先參照上述方法，構(gòu)建心功能不全動物模型，建模2個月后，將此組動物按隨機數(shù)字表法分為5個小組，標號為C1、C2、C3、C4、C5，每小組5只，然后進行單次腹腔注射STZ建立糖尿病模型，STZ劑量分別為40、45、50、55、60 mg/kg。注射STZ 72 h后測定大鼠尾靜脈隨機血糖，采血后紅霉素處理傷口，預防感染，造模成功后間隔2 d換墊料1次。

1.2.4糖尿病成模判斷標準以隨機血糖≥16.7 mmol/L[4-5]作為糖尿病大鼠成模標準，同時結(jié)合觀察注射STZ后平均進食量、進水量、活動量、體毛松散程度、精神萎靡情況、墊料濕度等，并定期監(jiān)測血糖和體質(zhì)量。

1.2.5大鼠心臟超聲檢查心功能不全誘導3個月后對大鼠行超聲心動圖檢查，實驗中超聲測定大鼠心率（HR）、射血分數(shù)（EF）、短軸縮短率（FS）、左室質(zhì)量（LV-mass）、心臟舒張末期室間隔厚度（IVSD）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVd）和收縮末期內(nèi)徑（LVs）、舒張末期左室后壁厚度（LVPWD）及二尖瓣血流頻譜E/A等，每個指標取3個連續(xù)心動周期測量的均值。

1.2.6心肌組織病理觀察腹主動脈縮窄后3個月，取大鼠心臟，生理鹽水沖洗，10%中性福爾馬林固定左室心肌組織，標本石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色。光鏡下觀察心肌細胞及心肌間質(zhì)的變化。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠體質(zhì)量、飲水飲食變化及一般狀態(tài)觀察3組大鼠初始體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學意義，1個月時，由于受手術(shù)創(chuàng)傷的影響，B、C組體質(zhì)量較A組下降，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01），2個月時，3組體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學意義。注射STZ后（3個月時），C組體質(zhì)量較A組、B組降低（P < 0.05），見表1。同時C組表現(xiàn)出多飲，多食，活動量減少，體毛松散、潮濕，精神萎靡，墊料呈酸臭味。

Tab. 1 The weight changes in three groups表1　各組大鼠不同時期體質(zhì)量變化（g，±s）

Tab. 1 The weight changes in three groups表1　各組大鼠不同時期體質(zhì)量變化（g，±s）

＊＊P < 0.01；a與A組比較，b與B組比較，P < 0.05；表2、3同

組別A組B組C組F n 10 10 25 0個月192.80±8.75 197.30±11.24 194.56±9.06 0.575 1個月300.10±15.54 281.67±10.57a280.24±7.82a13.318＊＊2個月366.70±10.69 360.89±16.93 364.72±11.40 0.530 3個月420.10±13.06 405.44±11.24a228.46±18.90ab564.460＊＊

2.2造模前后大鼠血糖水平變化各組大鼠基礎血糖水平差異無統(tǒng)計學意義，腹主動脈縮窄后2個月，B組較A組大鼠血糖無明顯改變。STZ注射72 h，C組大鼠血糖逐步趨向穩(wěn)定，大部分血糖水平≥16.7 mmol/L，較A、B組升高（P < 0.05），且持續(xù)至第4周，未見轉(zhuǎn)復。由于C1、C5亞組大鼠僅少量成模，因此，最終對其數(shù)據(jù)未進行統(tǒng)計學處理，見表2。

Tab. 2 The levels of blood glucose before and after modeling in three groups表2　各組大鼠造模前后隨機血糖變化（mmol/L，±s）

Tab. 2 The levels of blood glucose before and after modeling in three groups表2　各組大鼠造模前后隨機血糖變化（mmol/L，±s）

組別A組B組C1組C2組C3組C4組C5組F n 10 10 55555基礎血糖6.71±0.87 6.59±0.45 6.42±0.46 6.36±0.33 6.58±0.51 6.22±0.33 6.60±0.27 0.714 72 h血糖6.40±0.39 6.32±0.31 -23.06±2.51ab24.66±3.12ab26.84±3.23ab-194.779＊＊4周血糖6.24±0.35 6.46±0.49 -22.30±0.41ab27.83±0.51ab29.20±1.21ab-2 456.649＊＊

2.3大鼠超聲心動圖檢查腹主動脈縮窄3個月后，對B組和C組（C2～4）大鼠進行超聲檢查結(jié)果示，B組共10只，成模9只；C組大鼠共25只，成模11只。B組LV-mass、IVSD、LVs、LVPWD均較A組升高（P < 0.05）；C組HR、LV-mass、IVSD、LVs、LVP?WD均較A組升高（P < 0.05），B、C組E/A較A組下降（P < 0.05），各組EF、FS、LVd的差異無統(tǒng)計學意義，見表3。

2.4大鼠心肌組織不同切面病理改變A組橫切及縱切鏡下見心肌纖維排列整齊，心肌細胞大小、細胞核形態(tài)無異常，無血管擴張及血管周圍細胞浸潤等表現(xiàn)。B組鏡下顯示心肌纖維排列較前紊亂，局部心肌細胞肥大，心肌細胞間間隙增寬，間質(zhì)中少量炎癥細胞浸潤。C組鏡下顯示心肌纖維排列紊亂，血管壁外炎細胞浸潤，局部心肌細胞肥大，部分核大深染，心肌細胞間間隙增寬，間質(zhì)中大量炎癥細胞浸潤。見圖1。

Tab. 3 The echocardiographic results in three groups表3　大鼠心臟超聲檢查　(±s )

Tab. 3 The echocardiographic results in three groups表3　大鼠心臟超聲檢查　(±s )

組別A組B組C組F n 10 9 11 HR（次/min）342.50±26.52 349.22±19.64 364.00±21.54a2.450 EF 0.70±0.03 0.69±0.03 0.68±0.03 0.733 FS(%) 49.91±0.94 50.97±0.64 50.12±0.66 0.218 LV-mass(g) 0.70±0.08 0.83±0.06a0.91±0.07ab21.584＊＊組別A組B組C組F n 10 9 11 IVSD(mm) 1.41±0.11 1.50±0.05a1.52±0.04a6.929＊＊LVs(mm) 2.27±0.19 2.46±0.09a2.42±0.11a5.035＊LVd(mm) 4.98±0.13 5.03±0.08 5.05±0.09 1.109 LVPWD(mm) 1.43±0.06 1.62±0.10a1.64±0.10a17.427＊＊E/A 1.53±0.08 1.39±0.05a1.38±0.05a20.025＊＊

Fig.1 HE staining of myocardial different facets（×200）圖1　各組大鼠心肌組織不同切面HE染色（×200）

3　討論

隨著基礎和臨床研究的深入，心功能不全已不再被認為是單純的血流動力學障礙，而是由于多種神經(jīng)體液因子的參與，促使心功能不全持續(xù)發(fā)展的臨床綜合征。糖尿病則是心血管疾病死亡的獨立危險因素。多年前歐洲糖尿病研究協(xié)會（European As?sociation for the Study of Diabetes，EASD）就曾指出，2型糖尿病發(fā)生時，患者即存在一級心衰，糖尿病并發(fā)心衰是老年糖尿病患者最主要的轉(zhuǎn)歸，在臨床上2型糖尿病合并心功能不全的發(fā)病率和死亡率明顯高于一般人群，是非糖尿病患者的4～8倍。同時國外一項研究表明，糖尿病在心功能不全和正常的心衰患者中的患病率分別為28%和26%[6]，嚴重影響患者預后。為了更好地研究其內(nèi)在的發(fā)生發(fā)展機制，本研究首先對此混合疾病動物模型的構(gòu)建進行了初步探討。

本研究采用傳統(tǒng)腹主動脈縮窄[3]和STZ破壞胰島細胞[7]的方法構(gòu)建動物模型，實驗組采用7號注射針頭（去尖），縮窄后腹主動脈外徑減少約40%～ 50%，這與相關(guān)文獻報道[8]略有差異，可能與針頭大小、縮窄技巧與力度不一所致。對于傳統(tǒng)糖尿病造模，STZ劑量國內(nèi)外文獻報道不一[9]，總結(jié)原因，可能與動物種類、實驗條件、緩沖液性質(zhì)、注射部位及動物耐受性不同有關(guān)。而對于在心功能不全的基礎上構(gòu)建糖尿病大鼠模型，所需STZ劑量鮮見相關(guān)報道。本研究所用劑量分別為40、45、50、55、60 mg/kg，結(jié)果顯示：對于腹主動脈縮窄動物而言，在注射劑量為40 mg/kg時，僅部分大鼠血糖出現(xiàn)升高，隨著時間延長，大部分大鼠血糖呈現(xiàn)下降趨勢，表明糖尿病建模不成功，推斷可能原因是STZ劑量太小，胰島細胞破壞量少，且受損胰島細胞功能可以被正常胰島細胞代償，最終血糖下降，恢復正常水平。當注射劑量為45～50 mg/kg時，所構(gòu)建的大鼠模型穩(wěn)定性高，死亡率低，結(jié)合STZ成本，推薦優(yōu)先考慮45 mg/kg為最佳實驗劑量。當STZ劑量≥55 mg/kg時，動物后期血糖一直處于高水平且未見下降趨勢，大鼠日漸消瘦、并發(fā)癥和死亡率明顯升高，考慮原因為大劑量STZ導致大鼠胰腺大量破壞，最終糖、脂以及電解質(zhì)代謝發(fā)生嚴重紊亂。本研究同時顯示：對于心功能不全合并糖尿病大鼠，造模后動物表現(xiàn)出明顯的糖尿病癥狀，體質(zhì)量較正常組及腹主動脈縮窄組明顯下降，這與Pandey等[10]報道一致，推斷原因可能與其胰島素分泌不足，機體不能充分利用葡萄糖，使脂肪和蛋白質(zhì)分解加速來滿足能量代謝有關(guān)；后期大鼠心肌病理及心臟超聲進一步證實心肌出現(xiàn)肥厚改變，這與Dai等[11]研究結(jié)果相符，提示模型構(gòu)建成功。筆者曾嘗試對于混合模型的構(gòu)建順序進行改變，即先進行糖尿病建模，再行腹主動脈縮窄，但總體成模率低，主要原因是糖尿病動物血糖值高，對手術(shù)耐受性差，術(shù)后易感染，導致并發(fā)癥多、死亡率高。

綜上所述，采用腹主動脈縮窄2個月后單次腹腔注射45 mg/kg STZ的方法建立心功能不全合并糖尿病動物模型，方法簡便、可靠，所需STZ劑量小，建模后期動物血糖穩(wěn)定，死亡率低，適合實驗室和臨床相關(guān)疾病發(fā)生機制及藥物治療等研究。但對于混合模型構(gòu)建所需STZ劑量較正常糖尿病建模明顯減少的原因，本實驗尚未揭示，有待進一步研究。

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（2015-06-23收稿2015-09-24修回）

（本文編輯李國琪）

臨床研究

作者單位：1天津醫(yī)科大學三中心臨床學院（郵編300170）；2天津市第三中心醫(yī)院；3天津市港口醫(yī)院

Establishment and evaluation of rat model of cardiac insufficiency complicated with diabetes mellitus

LI Tianle1, LI Tong2△, HU Xiaomin2, YANG Fan2, WANG Lihong3, YANG Ling2
1 The Third Central Clinical Medical College of Tianjin Medical University, Tianjin 300170, China; 2 Tianjin Third Central Hospital; 3 Tianjin Port Hospital
△Corresponding Author E-mail: litong_3zx@sina.com

Abstract:Objective To establish a rat model of cardiac insufficiency complicated with diabetes mellitus (DM), and to meet the needs of clinical and laboratory studies. Methods Forty-five male specific pathogen free (SPF) rats were ran?domly divided into three groups: normal control group (A, n=10 ), coarctation of the aorta (AAC) group (B, n=10), AAC+DM group (C, n=25). The model of cardiac insufficiency with abdominal aortic constriction was establish in B and C groups. Af?ter two months of AAC, rats of group C were randomly divided into five subgroups and treated with different doses of strepto?zotocin (STZ) respectively(40, 45, 50, 55 and 60 mg/kg). The dynamic changes of general condition and weights were ob?served during the process of experiment. The blood glucose levels of 72 h and 4 week after STZ injection were detected. The echocardiograph and cardiac pathology changes were evaluated after 1 month of STZ injection. Results The general data in?cluding blood glucose levels, echocardiographic findings and myocardial tissue microscopic morphology were compared be?

tween different doses of STZ groups. The 45 mg/kg STZ was considered for more stable model of cardiac dysfunction compli?cated with diabetes mellitus. Conclusion The rat model of cardiac insufficiency complicated with diabetes mellitus is estab?lished by single dose injection of 45 mg/kg STZ after two-month AAC, which is a simple, reliable and high stability method.

Key words:cardiac insufficiency; diabetes mellitus,experimental; abdominal aortic constriction; disease models, ani?mal; rats, Wistar

中圖分類號：R-332

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/59135

基金項目：天津市衛(wèi)生局科技基金攻關(guān)資助項目（12KG106）

作者簡介：李田樂（1990），男，碩士在讀，主要從事先天性心臟病研究