Ⅳ期維吾爾族NSCLC患者EML4-ALK、EGFR基因突變狀態及生存分析

王強，張嶠，曹燕珍，陶潔，單莉△

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Ⅳ期維吾爾族NSCLC患者EML4-ALK、EGFR基因突變狀態及生存分析

王強1，張嶠1，曹燕珍2，陶潔1，單莉1△

摘要：目的探討棘皮動物微管樣蛋白4-間變淋巴瘤激酶（EML4-ALK）和表皮生長因子受體（EGFR）基因突變狀態與未經系統酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）治療的Ⅳ期維吾爾族非小細胞肺癌（NSCLC）患者長期生存的關系。方法收集97例未經TKIs治療的Ⅳ期維吾爾族NSCLC患者的組織標本，分別運用FISH及ARMS方法檢測EML4-ALK基因融合及EGFR基因突變狀態并進行生存分析。結果97例Ⅳ期維吾爾族NSCLC組織中，6例（6.2%）存在EML4-ALK基因融合，26例（26.8%）存在EGFR基因突變。生存分析顯示，EML4-ALK基因融合患者與EML4-ALK基因未融合患者總生存期（OS）差異無統計學意義（P=0.941），EGFR基因突變患者與EGFR野生型患者OS比較差異無統計學意義（P=0.607）。EGFR/EML4-ALK綜合突變對Ⅳ期維吾爾族NSCLC患者長期生存發現，EGFR突變型組、EML4-ALK陽性組、EML4-ALK陰性+EGFR野生型組患者中位OS分別為17.7、17.3、16.2個月，差異無統計學意義（P=0.915）。結論在排除TKIs治療影響的情況下，EML4-ALK融合基因與EGFR基因突變狀態尚不能作為評估Ⅳ期維吾爾族NSCLC患者預后的獨立因素。

關鍵詞:癌,非小細胞肺；受體,表皮生長因子；突變；維吾爾族；非小細胞肺癌；棘皮動物微管樣蛋白4-間變淋巴瘤激酶；生存分析

△通訊作者E-mail：shanlinew319@163.com

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，而其中80%以上為非小細胞肺癌（NSCLC）[1]。隨著分子遺傳學研究的不斷進展，NSCLC被細分為各種不同的分子亞型，并由此研發了各類分子靶向治療藥物。已有多項研究表明，對于初發表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor,EGFR）敏感突變的NSCLC患者，應用EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）治療在疾病控制率（objective response rate,ORR）、無進展生存期（progress free survival,PFS）和生活質量上均優于化療[2-3]。但另有研究認為排除使用EGFR-TKIs靶向治療的NSCLC患者后，EGFR基因突變并不影響其預后[4]。棘皮動物微管樣蛋白4-間變淋巴瘤激酶（echinoderm microtubule associated protein like 4-an?aplastic lymphoma kinase，EML4-ALK）是新發現的肺腺癌驅動基因。臨床試驗均證實EML4-ALK陽性肺癌患者對小分子ALK抑制劑均高度敏感，但EML4-ALK對晚期NSCLC患者的預后預測價值存在爭議[5- 6]。目前關于維吾爾族NSCLC患者與EML4-ALK基因融合及EGFR基因突變的研究鮮見報道。本研究對Ⅳ期維吾爾族NSCLC腫瘤組織EML4-ALK融合基因與EGFR基因突變狀態進行檢測，并分析患者的預后，以期為維吾爾族NSCLC患者的個體化治療、預后判斷提供依據。

1　資料與方法

1.1一般資料2005年9月—2012年11月就診于新疆醫科大學附屬腫瘤醫院肺內科一病區經病理組織學確診的Ⅳ期維吾爾族NSCLC患者，均有足夠的組織學標本行EGFR 及EML4-ALK基因檢測，且所有入組的患者均未行TKIs靶向治療。根據入組標準選取97例，其中女40例（41.2%），男57例（58.8%）；年齡30～77歲，中位年齡59歲；有吸煙史56例（57.7%）；鱗癌24例（24.7%），腺癌73例（75.3%）。

1.2方法

1.2.1EML4-ALK基因的FISH檢測使用ALK雙色分離探針試劑盒（Vysis LSI ALK Dual Color, Break Apart Rear?rangement Probe, Abbo Molecular），根據試劑盒說明進行操作。石蠟切片通過脫蠟等預處理后，依次進行蛋白酶處理、變性、雜交、細胞核染色。在熒光顯微鏡下隨機讀取50個腫瘤細胞，要求腫瘤細胞核輪廓及信號清晰，每個細胞核內至少有1組紅、綠信號，如果紅綠信號分離（距離2個信號直徑）或額外出現單獨的紅色信號，視為陽性細胞；50個觀察細胞中陽性細胞<5個為陰性標本，>25個為陽性標本；如果在5～25個之間則再計數50個細胞，100個細胞內合計陽性細胞數，>15個為陽性標本。

1.2.2EGFR基因檢測應用直接測序法或擴增阻滯突變系統（amplification refractory mutation system, ARMS,Qiagen Inc, Valencia, CA）檢測EGFR基因突變情況。按照試劑說明書進行操作，石蠟切片通過脫蠟等預處理后，依次進行消化、DNA提取及純化、PCR擴增、測序。將PCR產物純化后應用ABI 3730XL分析儀進行測序分析。陽性即8聯PCR管中A～G管，1個或1個以上突變陽性或弱陽性。陰性即8聯PCR管中A～G管，7管突變均為陰性。

1.3隨訪采用查閱病例資料及電話形式對患者進行隨訪，隨訪截止時間為2014年4月30日，生存期從確診Ⅳ期維吾爾族NSCLC之日起，至死亡日期為止；仍生存者至末次隨訪時間為止，其生存數據為截尾數據。隨訪時間為3.4～35個月，中位隨訪時間為16個月。對于失訪或非腫瘤原因導致的死亡以“存活”計，按截尾數據處理。

1.4統計學方法采用SPSS 17.0軟件進行分析，率的比較采用Pearson χ2檢驗，采用Kaplan-Meier方法估計組間生存率和繪制累積生存函數曲線，組間比較使用Log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1EML4-ALK基因融合和EGFR基因突變情況97例樣本中6例（6.2%）存在EML4-ALK基因融合，即EML4-ALK基因陽性，91例（93.8%）未檢測出EML4-ALK基因融合，即EML4-ALK基因陰性。26例（26.8%）存在EGFR基因突變，其中11例為21外顯子L858R點突變，14例為19外顯子缺失突變，1例為18外顯子G719X基因突變，無20外顯子T790M突變。EML4-ALK基因陽性的患者未見同時合并EGFR基因突變。見圖1～4。

Fig.1 Dual-color split FISH for NSCLC patients with positive EML4-ALK fusion gene（FISH,×100）圖1　EML4-ALK融合基因陽性NSCLC患者的FISH結果（FISH，×100）

Fig.2 Dual-color split FISH for NSCLC patients with negative EML4-ALK fusion gene（FISH，×100）圖2　EML4-ALK融合基因陰性NSCLC患者的FISH結果（FISH，×100）

Fig.3 ARMS results of EGFR gene mutations in NSCLC patients圖3　EGFR基因突變型NSCLC患者的ARMS結果

Fig.4 ARMS results of EGFR gene wild-type in NSCLC patients圖4　EGFR基因野生型NSCLC患者的ARMS結果

2.2EML4-ALK基因融合和EGFR基因突變與患者臨床病理特征的關系Ⅳ期維吾爾族NSCLC患者中不同性別、年齡、是否吸煙、不同病理類型患者EML4-ALK基因陽性率差異無統計學意義；女性EGFR基因突變率高于男性，非吸煙者高于吸煙患者，腺癌高于鱗癌（均P<0.05）。見表1。

Tab.1 Relationship between EML4-ALK fusion gene and EGFR gene mutation with clinicopathological characteristics of NSCLC patients表1　EML4-ALK基因融合和EGFR基因突變與NSCLC患者臨床病理特征的關系　例（%）

2.3生存分析本研究截至2014年4月30日，共有5例失訪，失訪率為5.2%，其中包括1例EGFR基因突變，4例既無EGFR基因突變又無EML4-ALK基因融合，其余均有完整隨訪資料。

2.3.1EML4- ALK基因融合對患者預后的影響EML4-ALK基因陰性患者中位總生存期（over?all survival，OS）為16.2（95%CI：14.3～18.2）個月，平均生存期為（14.6±1.8）個月；EML4-ALK基因陽性患者中位OS為17.3（95%CI：9.6～25.0）個月，平均生存期為（16.7±6.3）個月，EML4-ALK基因陽性患者與陰性患者間OS差異無統計學意義（Log-rank χ2= 0.006，P=0.941），見圖5。

Fig. 5 The correlation between the EML4-ALK fusion and the survival time in Uygur patients with stageⅣNSCLC圖5　EML4-ALK基因融合與Ⅳ期維吾爾族NSCLC患者生存時間的關系

2.3.2EGFR基因突變對患者預后的影響EGFR野生型患者中位OS為15.8（95%CI：13.6～18.0）個月，平均生存期為（14.6±1.1）個月；EGFR基因突變患者中位OS為17.5（95%CI：14.0～21.1）個月，平均生存期為（17.3±1.8）個月，EGFR基因突變患者與EGFR野生型患者OS差異無統計學意義（Log-rank χ2=0.265，P=0.607），見圖6。

Fig. 6 The correlation between the EGFR mutations and the survival time in Uygur patients with stageⅣNSCLC圖6　EGFR基因突變與Ⅳ期維吾爾族NSCLC患者生存時間的關系

2.3.3EGFR/EML4-ALK綜合突變對患者預后的影響考慮EML4-ALK基因陽性對EGFR基因野生型及EGFR突變基因型對EML4-ALK基因陰性的影響，將92例有完整隨訪資料的患者分為EGFR突變型、EML4-ALK陽性和EML4-ALK陰性+EGFR野生型3組進行生存分析，EGFR突變型組患者中位OS為17.7（95%CI：13.8～21.0）個月，平均生存期為（17.0±2.6）個月；EML4-ALK陽性組患者中位OS為17.3（95%CI：9.6～25.0）個月，平均生存期為（16.7±6.3）個月，EML4-ALK陰性+EGFR野生型組患者中位OS為16.2（95%CI：14.4～18.1）個月；平均生存期為（15.6±1.7）個月，3組間OS差異無統計學意義（Log-rank χ2=0.178，P=0.915），見圖7。

Fig. 7 The correlation between EGFR mutation, EML4-ALK fusion, and EML4-ALK negative+EGFR wild-type, and the survival time in patients with NSCLC圖7　EGFR基因突變、EML4-ALK基因融合及EML4-ALK陰性+ EGFR野生型與Ⅳ期維吾爾族NSCLC患者生存時間的關系

3　討論

EGFR的表達能激活下游重要的信號通路，從而導致細胞增殖、存活、轉移及血管生成等，因此在關于NSCLC的研究中，EGFR一直是一個熱點。相關研究顯示，EGFR基因突變在亞裔NSCLC中約占30%～40%，在西方高加索人人群中約占10%[7]。本研究中發現EGFR基因突變率為26.8%，低于亞裔人群而又高于西方人群，可能與不同種族之間突變率存在差異有關，但也有研究表明維吾爾族人群EGFR基因突變率與西方高加索人種突變率相似[8]，與本研究略有出入，可能與入組樣本量較小有關。本研究發現在Ⅳ期維吾爾族NSCLC中，女性、腺癌及不吸煙的患者EGFR基因突變較多見，與此前多項研究一致[9-10]。融合蛋白EML4-ALK是通過EML4和ALK兩個基因片段倒位融合所表達，這種融合基因能通過PI3K-AKT、MAPK和JAKSTAT途徑導致腫瘤的發生。既往研究顯示在未經選擇的NSCLC患者中EML4-ALK融合基因的發生率約為0.5%～11.6%[11]。本研究中EML4-ALK基因融合發生率處于相關研究報道范圍的中間偏高水平，明顯高于西方高加索人的0.4%～2.7%[11]，這可能與本研究樣本量較小及全部均為Ⅳ期患者有關。有研究表明Ⅲ、Ⅳ期NSCLC患者EML4-ALK基因融合比例明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者[12]。另有研究發現EML4-ALK基因融合更容易出現在既往少量或無吸煙史和年輕的患者，其病理類型多為腺癌，以腺泡癌和印戒細胞癌多見，且不會與EGFR和KRAS基因突變同時出現[13]。本研究結果卻提示EML4-ALK基因陽性率在不同性別、年齡、是否吸煙、不同病理類型的Ⅳ期維吾爾族NSCLC患者中無明顯差異，與上述研究報道有所差異，這可能與不同種族及EML4-ALK基因陽性比例在NSCLC人群中所占比例較低，以至于入組的研究病例數較少有關。本研究同樣發現不存在EGFR基因突變合并EML4-ALK基因融合的患者，與上述研究相吻合。

目前已有足夠的證據表明EGFR基因突變可作為EGFR-TKIs有效性的預測因子[2-3]，但對生存的影響尚不能明確。為排除NSCLC患者臨床分期對預后的影響，本研究均選取Ⅳ期NSCLC患者，同時排除了EGFR-TKIs治療的影響，使EGFR對預后的影響分析更為直接而準確。EGFR突變基因型與野生基因型患者的中位生存時間差異無統計學意義，因此在Ⅳ期維吾爾族NSCLC中，EGFR基因突變尚不能作為獨立的預后影響因素。這與多數報道一致。Ayyoub等[2]針對EGFR、KRAS基因突變與生存的關系進行了一項大規模的生存分析，其結果并未顯示出EGFR基因突變的患者生存時間延長。亦有研究發現手術切除的296例Ⅰ～Ⅲ期NSCLC患者中（排除術前術后采用EGFR-TKIs治療者），發生EGFR突變患者的3年OS優于EGFR野生型患者，可見EGFR突變是良好的預后因子[14]。

自Soda等[15]首次在NSCLC患者中發現新的融合基因EML4-ALK后，大多數研究的重點在于EML4-ALK基因融合與NSCLC患者臨床特征的關系，而該基因對維吾爾族人群NSCLC患者長期生存的影響鮮見報道。Shaw[5]、Amanda[16]兩位學者在2011、2014年先后報道EML4-ALK融合基因并非NSCLC患者的獨立預后因子。上述兩項研究中入組的研究對象均為歐洲白種人群，而本研究排除ALK-TKIs影響后EML4-ALK基因陽性與陰性患者OS差異無統計學意義。因此，在Ⅳ期維吾爾族NSCLC患者中，EML4-ALK融合基因突變與否同樣不能作為獨立的預后影響因素。同時本研究排除了EML4-ALK基因陽性對EGFR基因野生型及EGFR突變基因型對EML4-ALK基因陰性的影響，不論是EGFR突變基因還是EML4-ALK融合基因仍然不能作為判斷Ⅳ期維吾爾族NSCLC患者預后的影響因素。但也可能是由于樣本量較小，且EML4-ALK融合基因突變率本身較低，使得研究中的EML4-ALK融合基因患者較少，此外2組間確診后治療方案及一般情況不盡相同也會對結果造成影響，有待進一步驗證。

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（2015-05-08收稿2015-07-07修回）

（本文編輯李國琪）

作者單位：1新疆醫科大學附屬腫瘤醫院肺內科一病區（郵編830011），2病理科

EML4-ALK and EGFR mutation status and survival analysis in Uygur with stageⅣNSCLC

WANG Qiang1，ZHANG Qiao1，CAO Yanzhen2，TAO Jie1，SHAN Li1△
1 Department of Medical Oncology, 2 Department of Pathology, Tumor Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China
△Corresponding Author E-mail：shanlinew319@163.com

Abstract：Objective To investigate the relationship between the echinoderm microtubule associated protein like 4-anaplastic lymphoma kinase (EML4-ALK) and epithelial growth factor receptor (EGFR) mutation status and overall survival (OS) in Uygur patients with stageⅣnon-small cell lung cancer (NSCLC) who did not accept tyrosine kinase inhibitor treat?ment. Methods Totally 97 tissue samples were collected from Uygur patients with stageⅣNSCLC who did not accept tyro?sine kinase inhibitor treatment. EML4-ALK fusion gene and EGFR mutation status were detected by using FISH and ARMS methods. The survival rates were analysed. Results In 97 tissue samples, EML4-ALK fusion genes were found in 6 (6.2%) samples, EGFR mutations were found in 26 (26.8%) samples. The survival analysis showed that there was no significant dif?ference in OS between EML4-ALK fusion gene group and no EML4-ALK fusion gene group (P=0.941). There was no signifi?cant difference in OS between EGFR mutation group and wild-type EGFR group (P=0.607). The values of median OS were 17.7 months, 17.3 months and 16.2 months for EGFR mutant group, EML4-ALK positive group and EML4-ALK negative+ EGFR wild-type group, and thre was no significant difference between them (P=0.915). ConclusionExcluding the thera?peutic influence in TKIs, EML4-ALK fusion gene and EGFR mutation status of tumor tissue can not be used as an indepen?dent factor in assessing the prognosis in Uygur patients with stageⅣNSCLC.

Key words：carcinoma, non-small-cell lung; receptor, epidermal growth factor; mutation; UYGUR NATIONALITY; non-small cell lung cancer; EML4-ALK; survival analysis

中圖分類號：R734.2

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/58911

基金項目：吳階平醫學基金會臨床科研專項資助（320.6799.1130）

作者簡介：王強（1979），男，主治醫師，碩士研究生，主要從事胸部腫瘤的診斷及治療研究