博爾寧抑制S-180肉瘤細胞增殖抗癌作用機制研究

王秀萍,張瑩雯

(1. 武漢大學第二臨床學院,湖北 武漢 430000;2. 武漢大學中南醫院，湖北 武漢 430000)

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博爾寧抑制S-180肉瘤細胞增殖抗癌作用機制研究

王秀萍1,張瑩雯2

(1. 武漢大學第二臨床學院,湖北 武漢 430000;2. 武漢大學中南醫院，湖北 武漢 430000)

[摘要]目的觀察博爾寧對S-180肉瘤細胞及其實體瘤的增殖抑制作用，探討其抗腫瘤效應及與NF-κB的相關性。方法①體外實驗：體外培養S-180肉瘤細胞，分為空白組，博爾寧A組、B組、C組，5-Fu組，聯合給藥組，分別培養24，48，72 h，MTT法檢測細胞體外增殖程度，計算增殖抑制率。②體內實驗：將含S-180肉瘤細胞的小鼠乳白色腹水接種于50只雄性裸小鼠右側腋窩皮下，然后隨機將裸小鼠分為5組，空白組給予生理鹽水灌胃，5-Fu組給予5-Fu 10 μg/mL灌胃，博爾寧A組、B組、C組給予10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL博爾寧灌胃。灌胃15 d后取材，計算抑瘤率，RT-PCR法檢測瘤組織NF-κp65 RNA的表達情況，考馬斯亮蘭法檢測NF-κB蛋白濃度，凝膠電泳遷移率試驗(EMSA)檢測NF-κB活性。結果在體外，博爾寧呈濃度依賴性抑制S-180肉瘤細胞增殖，且在處理48 h時作用最佳。在體內，博爾寧各組荷瘤裸鼠的瘤質量呈濃度依賴性下降，差異均有統計學意義(P均<0.05)，博爾寧C組與5-Fu組抑瘤率比較差異無統計學意義(P>0.05)；各給藥組瘤組織NF-κB p65 RNA及蛋白表達水平均明顯低于空白組(P均<0.05)，并隨著博爾寧濃度的增加逐漸降低，各組間比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。結論博爾寧可顯著抑制S-180肉瘤細胞和實體瘤的增殖，其作用與降低NF-κB的表達、抑制其活性有關。

[關鍵詞]博爾寧；S-180肉瘤細胞；增殖；NF-κB

癌癥是全球范圍內導致死亡的主要原因之一，且其發病率和死亡率均呈上升趨勢，據世界衛生組織2014年癌癥報告顯示，2012年全球約有1 400萬新發癌癥患者，其中20%發生在我國，在未來20年每年癌癥新發病例將達到2 200萬[1]，故積極探索有效的抗腫瘤藥物具有重要的現實意義。近年來，中醫藥以其不良反應小、治療全面等獨特優勢成為臨床腫瘤治療的新選擇。博爾寧由黃芪、女貞子、山慈菇、重樓、龍葵、紫蘇子、僵蠶、大黃等制成，已被證實可用于胃癌[2]、肝癌[3]、非小細胞肺癌[4]等多種惡性腫瘤的治療，并取得較好的療效，但其具體作用機制尚未明確。核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是一種重要的核轉錄因子，廣泛存在于各種細胞中，它參與細胞內的信號傳遞，調控多種基因的表達，與多種腫瘤的發生密切相關[5-6]。本研究擬從體內和體外研究博爾寧對S-180肉瘤細胞及其實體瘤增殖的影響，明確其作用時間、劑量與抑瘤效果關系，探討博爾寧抗腫瘤作用機制及其與NF-κB的相關性。

1實驗資料

1.1試劑 NF-κB核蛋白提取試劑盒購自凱基生物，RPMI1640培養基、定量PCR試劑盒購自TOYOBO，EMSA試劑盒購自Thermo Scientific公司，MTT檢測試劑盒、PBS緩沖液購自Aspen公司。博爾寧、5-Fu由武漢大學中南醫院藥房提供。

1.2細胞培養S-180肉瘤細胞由武漢大學病毒研究中心提供，培養于含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養基中，37 ℃ 25%CO2、飽和濕度條件下擴增培養，鏡下S-180肉瘤細胞呈圓形或橢圓形，均勻懸浮在培養瓶中，每1～2 d傳代1次。體外實驗在第5天開始，傳代細胞給予冷凍保存。體外實驗結束后繼以上法培養細胞，第4天開始接種小鼠。

1.3體外實驗

1.3.1實驗分組分為空白組(加入100 μL RPMI 1640培養液)，5-Fu組(加入100 μL 5-Fu 10 μg/mL)，博爾寧A組、B組、C組(分別加入3種不同濃度博爾寧100 μL，使藥物終濃度為10，20，40 μg/mL)，聯合用藥組(5-Fu 10 μg/mL+博爾寧40 μg/mL各半)。

1.3.2MTT法檢測細胞增殖活性細胞株常規培養后取指數生長期細胞用完全RPMI1640培養基調整至2×108L-1，接種于96孔板中，每孔接種細胞懸液100 μL，5% CO2，37 ℃孵育至細胞單層鋪滿孔底，分別加入上述分組藥物，每組設5個復孔，分別培養24,48,72 h后終止反應，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)繼續培養4 h，離心后小心棄去培養液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，在振蕩器上振蕩10 min后，于酶標儀中檢測各孔570 nm波長的光密度值(OD)，實驗重復3次，抑制率按下列公式計算：抑制率(%)=(1-加藥孔平均OD值)/對照孔平均OD值×100%。

1.4體內實驗

1.4.1實驗動物與分組雄性裸小鼠50只，體質量(20±2)g，購自武漢大學ABSL-3動物實驗中心。取體外培養的S-180肉瘤細胞接種于小鼠腹腔，腹水形成后轉種3次，抽取生長最佳狀態的乳白色腹水，用生理鹽水稀釋成1×109L-1，以每只0.2 mL的量接種于裸小鼠右側腋窩皮下，然后隨機分為空白組，5-Fu組，博爾寧A組、B組和C組，每組10只。接種S-180肉瘤細胞5 d后可見實體瘤突起，開始灌胃，各組灌胃劑量均為0.2 mL/10g，空白組給予生理鹽水，5-Fu組給予5-Fu 10 μg/mL，博爾寧A組、B組、C組給予濃度分別為10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的博爾寧，均1次/d，連續給藥15 d后處死。實驗結束時無死亡。

1.4.2抑瘤率計算給藥完畢后，斷頸處死裸鼠，并剝離皮下瘤塊，稱瘤質量，計算抑瘤率，抑瘤率計算公式：抑瘤率(%)=(模型組瘤質量-實驗組瘤質量)/模型組瘤質量。

1.4.3瘤體組織中NF-κBp65 RNA表達檢測采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測。從腫瘤組織提取總RNA，按試劑盒操作說明書進行，并用生物分析儀對總RNA進行完整性檢測及濃度測定。逆轉錄反應條件：42 ℃ 30 min，80 ℃ 5 min，完成后-20 ℃保存。PCR擴增引物由Invitrogen Biotechnology Co, LTD中國公司合成，信息見表1；反應條件：94 ℃ 1 min(變性)，58 ℃ 1 min(退火)，72 ℃ 1 min(延伸)的順序進行32個循環，72 ℃延伸10 min。分別取PCR產物和β-actin擴增產物各10 μL混勻后行2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)做熒光指示劑，然后應用自動凝膠成像分析系統進行吸光度掃描，測得數據用2△△Ct 法分析基因表達，以Ct-NF-κB/與Ct-β-actin的比值進行統計學分析。

表1　PCR引物信息

1.4.4腫瘤組織中NF-κB活性檢測采用電泳遷移率實驗(EMSA)檢測。腫瘤組織蛋白提取嚴格按照說明書操作。取少量用考馬斯亮蘭(Bradford法)測定提取物中蛋白濃度，剩余部分凍存備用。蛋白與探針反應體系(各組總體積均為20 μL)：陰性對照反應(標記探針)；陽性對照(含激活的目的轉錄因子的核蛋白+標記探針)；探針冷競爭反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白+標記探針+標記探針200倍量的未標記探針)；常規反應(待測樣品核蛋白+標記探針，同上述實驗分組)。上述反應體系配置好后，室溫放置20 min，隨后加5 μL的5×上樣緩沖液到樣品混合液中，于150 V反應30～45 min。待電泳完成并轉膜后于紫外燈下交聯10 min，采用凝膠成像系統及分析系統進行條帶分析。

2結果

2.1各組體外培養S-180肉瘤細胞增殖抑制率比較 MTT檢測結果顯示博爾寧可顯著抑制S-180肉瘤細胞的增殖，在同時間段內，博爾寧呈濃度依賴性抑制S-180肉瘤細胞增殖，各組間比較差異均有統計學意義(P均<0.05)；5-Fu組各時間段抑制率均明顯高于博爾寧C組(P均<0.05)，聯合用藥組與5-Fu組比較差異無統計學意義(P均>0.05)。各給藥組均在處理48 h時抑制率明顯高于24，72 h(P均<0.05)。見表2。

表2　各組體外培養S-180肉瘤細胞增殖

注：①與博爾寧A組比較，P<0.05；②與博爾寧B組比較，P<0.05；③與博爾寧C組比較，P<0.05；④與培養48h比較，P<0.05。

2.2各組荷瘤裸小鼠瘤質量及抑瘤率比較各給藥組荷瘤裸小鼠瘤質量均明顯低于空白組(P均<0.05)；博爾寧各組瘤質量呈濃度依賴性下降，抑瘤率呈濃度依賴性升高，差異均有統計學意義(P均<0.05)；博爾寧C組與5-Fu組瘤質量及抑瘤率比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表3。

表3　各組荷瘤裸小鼠瘤質量及抑瘤率比較

注：①與空白組比較，P<0.05；②5-Fu組比較，P<0.05；③與博爾寧A組比較，P<0.05；④與博爾寧B組比較，P<0.05。

2.3各組實體瘤內NF-κB p65 mRNA表達量比較 熒光定量PCR結果顯示，各給藥組腫瘤組織中NF-κB p65 mRNA表達水平明顯低于空白組(P均<0.05)，博爾寧各組腫瘤組織中NF-κB表達水平呈濃度依賴性下降，組間比較差異均有統計學意義(P均<0.05)；5-Fu組與博爾寧C組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1　各組NF-κB p65 mRNA 表達量比較

2.4各組實體瘤組織中NF-κB蛋白表達水平及活性比較各給藥組腫瘤組織中NF-κB表達水平均明顯低于空白組(P均<0.05)；博爾寧各組腫瘤組織中NF-κB表達水平呈濃度依賴性下降，組間比較差異均有統計學意義(P均<0.05)；5-Fu組與博爾寧C組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。EMSA實驗顯示，各給藥組腫瘤組織中NF-κB結合條帶灰度值均明顯低于空白組，且隨著博爾寧濃度增加，NF-κB活性呈濃度依賴性下降，博爾寧C組與5-Fu組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

表4　各組實體瘤組織內NF-κB蛋白表達水平比較±s)

注：①與空白組比較，P<0.05；②5-Fu組比較，P<0.05；③與博爾寧A組比較，P<0.05；④與博爾寧B組比較，P<0.05。

1為空白組，2為5-Fu組，3為博爾寧A組，

3討論

惡性腫瘤的發生與體內正常細胞基因突變及其過度增殖密切相關，突變的腫瘤細胞持續增殖，不僅破壞原有的器官、組織結構的功能和形態，還可浸潤、侵犯周邊及遠處組織，最終導致廣泛轉移，嚴重威脅患者生命。控制腫瘤增生及轉移是防治惡性腫瘤的主要目標之一。中醫藥對“癌”的認識由來已久，古書中記載的“腎巖”“乳巖”“噎膈”等均屬于癌癥范疇。近年來中醫癌毒學說被普遍接受，癌毒與氣滯、血瘀、痰凝等致癌因素相兼是腫瘤發生的關鍵，癌毒的產生與正氣不足、邪氣內生或外邪內侵相關，而正氣虧虛是其根本。在治療上周仲瑛教授認為可采用抗癌解毒、活血化瘀、軟堅散結與整體辨證相結合[7]。博爾寧組方以黃芪、女貞子等扶正固本為主，與山慈菇、重樓、龍葵等解毒中藥相結合，并含有大黃、僵蠶等軟堅散結成分，符合現代腫瘤治療的組方思想，具有益氣活血、散結消腫、扶正祛邪等功效，現在臨床上常將其作為腫瘤治療的輔助用藥，認為其可增強患者的免疫力，提高機體抗病能力[3]，并可協助化療，具有較好的抗腫瘤作用[8-9]。

NF-κB是一種重要的核轉錄因子，調控多種基因的轉錄，其在諸多惡性腫瘤組織中高表達。靜息狀態下，NF-κB以二聚體的形式(主要是p50/p65)與其抑制性蛋白(IkB)結合存在于細胞質中，其含量很少，當細胞受到各種刺激時，IkB被磷酸化而降解，使NF-κB二聚體得以釋放激活，并轉移到細胞核，與目的基因結合促進其轉錄，在正常組織中激活的NF-κB很快被反饋性抑制而失活。當細胞惡變時，體內多種微環境變化均可激活NF-κB[10]，并呈持續性，直接導致受NF-κB調控的下游基因表達失控，其中就包括與腫瘤細胞增殖相關的雌激素受體(EHR2)[11]、血管內皮生長因子(VEGF)[12]、神經生長因子(NGF)[13]等，直接誘導腫瘤細胞增殖。NF-κB還可促進惡性腫瘤的侵襲和遷移[14-15]，誘導其抗凋亡作用[16]，使惡性細胞永生化，也是其促進腫瘤增殖的一個重要證據。p65是NF-κB家族的重要成員，研究發現在p65中存在著轉錄激活區域，是NF-κB促進轉錄的主要環節之一，通過封閉p65啟動子區域可以對抗NF-κB引起的惡性細胞增殖，促進其凋亡[17]。

本研究結果顯示，在體外，博爾寧可明顯抑制S-180肉瘤細胞的增殖，并呈一定的濃度依賴性，但其抑制作用低于臨床常用化療藥物5-Fu，且博爾寧與5-Fu聯合用藥組抑制率與5-Fu組比較差異無統計學意義，提示兩藥之間并無協同作用；各給藥組均在處理48 h時抑制率明顯高于24，72 h，提示博爾寧抑制S-180肉瘤細胞增殖的最佳時間可能是給藥后48 h。體內試驗發現，博爾寧各組荷瘤裸鼠的瘤質量呈濃度依賴性下降，博爾寧C組與5-Fu組抑瘤率比較差異無統計學意義。證實博爾寧可有效抑制體內S-180實體瘤的增殖，且其體內抗腫瘤作用強于體外抑制惡性腫瘤細胞增殖作用，說明除直接抑制腫瘤細胞的增殖外，還可能存在其他抗腫瘤機制，如改善機體內環境、提高免疫力等，具體機制尚有待進一步研究。為進一步明確其抗腫瘤機制與NF-κB之間的相關性，本研究檢測腫瘤組織中NF-κB mRNA、蛋白的活性及含量，發現各給藥組瘤組織NF-κb p65 mRNA及蛋白表達水平均明顯低于空白組，并隨著博爾寧濃度的增加逐漸降低，這與體內及體外腫瘤增殖抑制率保持一致，提示博爾寧的抗腫瘤效應與其對NF-κB的抑制有一定的相關性。

綜上所述，博爾寧可有效抑制S-180肉瘤細胞及其實體瘤的增殖，除直接抑制腫瘤細胞增殖外，尚存在其他抗腫瘤效應，而其機制與抑制NF-κB的活性及表達相關。

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Study on the anti-cancer mechanism of inhibition of Boerning in proliferation of S-180 cell

WANG Xiuping1，ZHANG Yingwen2

(1. The Second Clinical College of Wuhan University, Wuhan 430000,Hubei,China; 2. Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430000, Hubei, China)

Abstract：Objective It is to explore the anti-tumor effect of Boerning and its' relationship with NF-κB by inhibiting the proliferation of S-180 tumor cells. Methods In vitro, S-180 cell was divided into six groups: the control group, 5-Fu group, Boerning A-C groups and combination regimen group, and they were cultivated for 24,48,72 hours respectively. MTT method was used to detect the degree of cell proliferation and get the inhibitory rate. In vivo, fifty nude mice were randomly divided into 5 groups: control group, Boerning A-C groups and 5-Fu group, which were treated with normal saline, 10 μg/mL,20 μg/mL,40 μg/mL Boerning and 10 μg/mL 5-Fu by gavage respectively. Then the tumor tissue was obtained fifteen days later and calculated the inhibitory rate. The expression of NF-κBp65 RNA,NF-κB protein concentration and the activity of NF-κB were detected by RT-PCR, Coomassie blue staining and electrophoretic mobility shift assay respectively. Results In vitro, Boerning could inhibit the proliferation of S-180 cell with a concentration-dependent manner, and had the best effect when dealing with 48 hours. In vivo, the tumor weight of nude mice was decline as the increase of concentration of Boerning, all had significant difference(P<0.01 or 0.05). There was no statistically difference in inhibitory rate between Boerning C group and 5-Fu group (P>0.05). The RNA and protein expression of NF-κB decreased gradually with the increased concentration of Boerning, there was a markedly difference (P<0.05 or 0.01) between each groups. Conclusion Boerning can significantly inhibit the proliferation of S-180 cells by in vitro and vivo and its effect is closely related with the inhibition of the expression and activity of NF-κB.

Key words：Boerning；S-180 cells；proliferation；NF-κB

[收稿日期]2015-04-18

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)01-0011-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.01.004

[基金項目]湖北省自然科學基金資助項目(2009CHB001)

[作者簡介]王秀萍，女，碩士研究生在讀，研究方向為中西醫結合內分泌疾病的診治。