布拉氏酵母菌在非酒精性脂肪性肝病中的作用研究

任 帥，荊 雷，李 丹，王 研，李異玲

中國醫科大學附屬第一醫院消化內科，遼寧 沈陽 110001

論著·非酒精性脂肪性肝病

布拉氏酵母菌在非酒精性脂肪性肝病中的作用研究

任 帥，荊 雷，李 丹，王 研，李異玲

中國醫科大學附屬第一醫院消化內科，遼寧 沈陽 110001

目的 探討布拉氏酵母菌在高脂飲食誘導的大鼠非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)模型中的作用。方法 36只雄性SD大鼠隨機分成4組，每組9只，1組：對照組；2組：高脂飲食組(82.5%普通飼料+10%豬油+2%膽固醇+0.5%膽酸鈉+5%蛋黃粉)；3組：布拉氏酵母菌組；4組：高脂飲食+布拉氏酵母菌組。每組分別于第4周、8周、12周處死3只大鼠，進行血清學檢測和肝臟病理分析。結果 第8周時高脂飲食組大鼠體質量明顯大于對照組[(413.67±41.02)gvs(297.80±25.31)g，P<0.05]；高脂飲食組大鼠ALT、AST、TC、TG明顯高于對照組(P<0.05)；高脂飲食+布拉氏酵母菌組大鼠體質量大于對照組，但小于高脂飲食組，差異有統計學意義(P<0.05)。第12周時高脂飲食組大鼠肝臟指數明顯大于對照組[(3.455±0.263)%vs(2.609±0.377)%，P<0.05]；高脂飲食組大鼠ALT、AST、TC、TG明顯高于對照組(P<0.05)；高脂飲食+布拉氏酵母菌組大鼠ALT、AST、TC、TG低于高脂飲食組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 布拉氏酵母菌可改善NAFLD大鼠的血清學及肝臟脂肪變性。

非酒精性脂肪性肝病；布拉氏酵母菌；高脂飲食

高脂飲食是非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的危險因素之一，伴隨高血脂可促進NAFLD的發生，同時，高脂飲食可造成腸道菌群紊亂，從而加重肝臟炎癥反應，加劇NAFLD[1]。

腸-肝軸學說認為腸道改變在NAFLD發病過程中起重要作用。這一學說是由研究人員[2]在建立小鼠小腸細菌過量生長(small intestinal bacterial overgrowth，SIBO)模型時發現SIBO小鼠的NAFLD發病率明顯高于正常小鼠，對這一現象進行深入研究后發現的。肝和腸有共同胚胎學起源，流經腸道的血液通過血管進入門靜脈，并流經肝臟，所以當腸道中菌群發生改變，腸黏膜被破壞，腸道中細菌毒素、抗原等物質可經腸道與肝臟之間的血管系統進入肝臟，從而激活肝臟中的Kuffer細胞等免疫細胞，促進免疫因子的產生及免疫系統的激活，推動二次打擊對肝細胞的損傷[3]。

腸道在NAFLD中的作用一方面與腸道的通透性相關，腸黏膜通透性增加導致腸道屏障作用下降，腸道中細菌毒素經門靜脈系統進入肝臟，從而導致肝臟纖維化加劇[4]，另一方面與腸道菌群有關，當使用抑菌藥改善腸道中菌群平衡時，NAFLD實驗動物肝纖維化程度得到明顯改善[5]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物：SPF級健康雄性SD大鼠36只，初始體質量(260±10)g，中國醫科大學動物部提供。大鼠飼養環境溫度為(20±2)℃，濕度為(50±5)%，實驗前一周將大鼠放置于實驗環境中，自然晝夜節律周期，自由進食進水。實驗主要試劑：億活(布拉氏酵母菌散)(Biocodex，法國)；10%水合氯醛(中國醫科大學動物實驗中心)；10%多聚甲醛(中國醫科大學基礎病理學研究室)；主要儀器：Leica RM2235石蠟切片(Leica，德國)；光學顯微鏡(Olympus，日本)；Olympus AU600全自動生化分析儀(Olympus，日本)；離心機(上海醫用離心機廠，中國)；精密秤(沈陽龍騰電子稱量有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠NAFLD模型制備與實驗分組：將36只雄性SD大鼠隨機分成四組，1組：對照組(給予普通飼料)；2組：高脂飲食組(82.5%普通飼料+10%豬油+2%膽固醇+0.5%膽酸鈉+5%蛋黃粉)；3組：布拉氏酵母菌組(普通飲食，第4周開始使用布拉氏酵母菌灌胃，布拉氏酵母菌散10 mg·kg-1·d-1)；4組：高脂飲食+布拉氏酵母菌組(高脂飲食喂養，第4周開始使用布拉氏酵母菌灌胃)，每組9只，第4周、8周、12周各組均處死3只大鼠。

1.2.2 標本采集：分別于造模第4周、8周、12周后處死大鼠，采集大鼠血清、肝臟標本。大鼠處死前禁食12 h后，10%水合氯醛麻醉(0.3 ml/100 g)，稱取大鼠體質量。腹主動脈取血5～10 ml，使用非抗凝管收集，血液凝固后，4 ℃放置30 min，3 000 r/min離心15 min，取上層血清低溫保存待用。麻醉大鼠，剪開腹膜，取肝臟，用冰生理鹽水清洗肝臟，稱取肝臟重量，取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm肝臟組織用10%多聚甲醛固定，低溫保存。

1.2.3 觀察指標與檢測方法：觀察大鼠食欲、精神、毛發情況。測體質量和肝濕重，計算肝指數(肝濕重/體質量×100%)。使用Olympus AU2700全自動生化分析儀檢測血清天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)。肝臟病理HE染色，將經過HE染色的肝臟切片置于鏡下觀察。

1.3 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件進行處理，組間比較采用單因素方差分析，統計量為F值，檢驗水準為0.05。若方差分析有統計學意義則采用LSD法進行兩兩比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況 隨著造模時間的延長，對照組和布拉氏酵母菌組大鼠食欲佳，皮毛光滑，精神狀態好。高脂飲食組和高脂飲食+布拉氏酵母菌組大鼠自造模開始至第8周食欲亦佳，皮毛光滑，但在造模第8周后食欲尚可，精神逐漸萎靡，皮毛欠光滑。

2.2 各組大鼠體質量、肝指數水平 第4周時各組大鼠體質量、肝指數水平差異均無統計學意義(P>0.05)；第8周時高脂飲食組大鼠體質量明顯大于對照組，高脂飲食+布拉氏酵母菌組大鼠體質量大于對照組，但小于高脂飲食組，差異有統計學意義(P<0.05)。第8周及第12周時高脂飲食組大鼠肝指數均明顯大于對照組，且差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.3 血清學指標測定 第8周時高脂飲食組大鼠ALT、AST、TC、TG明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。第12周時高脂飲食組大鼠AST、ALT、TC、TG明顯高于對照組，高脂飲食+布拉氏酵母菌組大鼠AST、ALT、TC、TG低于高脂飲食組，差異有統計學意義(P<0.05);雖高于對照組，但差異無統計學意義(P>0.05,見表2)。

表1 各組大鼠體質量、肝指數水平Tab 1 The weight and liver index of rats in each group ±s)

注：與1組相比，*P<0.05；與2組相比，△P<0.05。

2.4 病理組織學檢測 肉眼觀察：對照組與布拉氏酵母菌組大鼠肝臟鮮紅、邊緣銳利、質韌；高脂飲食組第8周、12周肝臟體積明顯增大，包膜緊張、邊緣較頓、色偏黃、質地略軟、切面油膩；與高脂飲食組相比，高脂飲食+布拉氏酵母菌組大鼠肝質變性程度均有不同程度的改善。取肝右葉組織1塊，用于HE染色。對照組：第4周、8周及12周時肝細胞索均以肝小葉中央靜脈為中心呈放射狀排列，匯管區無明顯炎性細胞浸潤；高脂飲食組：第4周時脂肪變肝細胞占30%，8周時占60%，第12周時占80%；布拉氏酵母菌組：第4周、8周及12周時肝細胞索均以肝小葉中央靜脈為中心呈放射狀排列，匯管區無明顯炎性細胞浸潤；高脂飲食+布拉氏酵母菌組：第4周時脂肪變肝細胞占30%，第8周時占30%，第12周時占40%～50%(見圖1～4)。

表2 各組大鼠血清學指標±s)Tab 2 Serologocal indicators of rats in each group ±s)

注：與1組相比，*P<0.05；與2組相比，△P<0.05。

圖1 對照組大鼠肝臟染色(200×) A：4周；B：8周；C：12周Fig 1 Liver staining in the control group (200×) A: 4 weeks; B: 8 weeks; C: 12 weeks

圖2 高脂飲食組大鼠肝臟染色(200×) A：4周；B：8周；C：12周Fig 2 Liver staining in the high fat diet group (200×) A: 4 weeks; B: 8 weeks; C: 12 weeks

圖3 布拉氏酵母菌組大鼠肝臟染色(200×) A：4周；B：8周；C：12周Fig 3 Liver staining in the Saccharomyces boulardii group (200×) A: 4 weeks; B: 8 weeks; C: 12 weeks

圖4 高脂飲食+布拉氏酵母菌組大鼠肝臟染色(200×) A：4周；B：8周；C：12周Fig 4 Liver staining in the high fat diet+Saccharomyces boulardii group (200×) A: 4 weeks; B: 8 weeks; C: 12 weeks

3 討論

NAFLD的發病機制主要包括目前被廣泛認可的“二次打擊”假說[6]及脂質代謝紊亂。除上述原因外，腸道菌群異常所致腸道毒素吸收增加也在NAFLD的發病中占重要地位。B?ckhed等[7]研究發現，向無菌小鼠腸道內定植正常小鼠的腸道菌群，無菌小鼠在攝食減少的情況下體質量顯著增長。Torres等[8]研究發現，對NAFLD模型小鼠給予雙歧桿菌干預，小鼠肝損傷程度下降，對相關機制進一步研究顯示，雙歧桿菌改善腸道菌群從而降低血中脂多糖水平，并改善胰島素抵抗，從而改善肝纖維化。

布拉氏酵母菌散在上世紀20年代被開發，1961年正式上市，主要用于抗腸道中毒素，如大腸桿菌脂多糖、霍亂毒素，調節腸道菌群平衡[9]。調節腸道菌群是治療NAFLD的治療手段之一，目前主要使用抗生素或益生菌等調節腸道菌群[10]。但對于布拉氏酵母菌治療NAFLD研究較少。

本研究通過復制NAFLD大鼠模型，同時給予布拉氏酵母菌進行治療干擾。各組大鼠不同時間點體質量、肝指數水平、血清學水平及肝臟病理結果提示：高脂飲食可導致體質量和肝指數明顯升高，引起肝臟損傷、血脂升高，同時可導致肝臟脂肪變性。布拉氏酵母菌可改善肝臟損傷、降低血脂水平、肝臟脂肪變性。對照組和布拉氏酵母菌組實驗結果與高脂飲食組相比，差異無統計學意義，同時高脂飲食+布拉氏酵母菌組大鼠應用布拉氏酵母菌后狀態良好，無不良反應出現，說明億活(布拉氏酵母菌散)對正常大鼠不存在副作用，具有用藥安全的特點。總之，本實驗成功證實高脂飲食可以誘導大鼠NAFLD模型，布拉氏酵母菌能夠減輕肝損傷，改善肝臟脂肪變性。

綜上，高脂飲食誘導大鼠NAFLD模型成功；布拉氏酵母菌可改善大鼠NAFLD的血清學及肝臟脂肪變性。

[1]Nanji AA. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease and steatohepatitis [J]. Clin Liver Dis,2004,8(3): 559-574,ix.

[2]Zhan YT,An W. Roles of liver innate immune cells in nonalcoholic fatty liver disease [J]. World J Gastroenterol,2010,16(37): 4652-4660.

[3]Elinav E,Ali M,Bruck R,et al. Competitive inhibition of leptin signaling results in amelioration of liver fibrosis through modulation of stellate cell function [J]. Hepatology,2009,49(1): 278-286.

[4]Abbas G,Silveira MG,Lindor KD. Hepatic fibrosis and the renin-angiotensin system [J]. Am J Ther,2011,18(6): e202-e208.

[5]Miura K,Kodama Y,Inokuchi S,et al. Toll-like receptor 9 promotes steatohepatitis by induction of interleukin-1beta in mice [J]. Gastroenterology,2010,139(1): 323-334,e7.

[6]Polyzos SA,Kountouras J,Zavos C,et al. The role of adiponectin in the pathogenesis and treatment of non-alcoholic fatty liver disease [J]. Diabetes Obes Metab,2010,12(5): 365-383.

[7]B?ckhed F,Ding H,Wang T,et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage [J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(44): 15718-15723.

[8]Torres DM,Williams CD,Harrison SA. Features,diagnosis,and treatment of nonalcoholic fatty liver disease [J]. Clin Gastroenterol Hepatol,2012,10(8): 837-858.

[9]Dassanayake AS,Kasturiratne A,Rajindrajith S,et al. Prevalence and risk factors for non-alcoholic fatty liver disease among adults in an urban Sri Lankan population [J]. J Gastroenterol Hepatol,2009,24(7): 1284-1288.

[10]Schwimmer JB,Celedon MA,Lavine JE,et al. Heritability of nonalcoholic fatty liver disease [J]. Gastroenterology,2009,136(5): 1585-1592.

(責任編輯：王全楚)

Effect of Saccharomyces boulardii in non-alcoholic fatty liver disease

REN Shuai,JING Lei,LI Dan,WANG Yan,LI Yiling

Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China

Objective To explore the role of Saccharomyces boulardii in the non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) rats induced by high fat diet. Methods A totol of 36 male SD rats were randomly divided into 4 groups (control group,high fat diet group,Saccharomyces boulardii group,high fat diet+Saccharomyces boulardii group). Three rats were killed in each group at the 4th,8th,12th weeks,serological detection and liver pathological results were analyzed.Results At the 8th week: weight of rats in high fat diet group was obviously higher than that in the control group [(413.67±41.02)gvs(297.80±25.31)g,P<0.05]; ALT,AST,TC,TG in high fat diet group were obviously higher than those in the control group,there was statistically significant (P<0.05); weight of rats in high fat diet+Saccharomyces boulardii group was higher than that in the control group,but lower than that in the high fat diet group (P<0.05). At the 12th week: liver index in the high fat diet group was obviously higher than that in the control group [(3.455±0.263)%vs(2.609±0.377)%,P<0.05];ALT,AST,TC,TG in high fat diet group were significantly higher than those in the control group (P<0.05); ALT,AST,TC,TG in high fat diet+Saccharomyces boulardii group were higher than those in the control group,but lower than those in the high fat diet group (P<0.05). Conclusion Saccharomyces boulardii can improve the serology and hepatic steatosis in rats with NAFLD.

Non-alcoholic fatty liver disease; Saccharomyces boulardii; High fat diet

遼寧省科技廳基金資助項目(2011225015)；沈陽市科技廳基金資助項目(F13-220-9-61)；留學回國人員科研啟動資金資助項目，教外司留([2014]1685號)

任帥，碩士，研究方向：非酒精性脂肪性肝病的基礎與臨床。E-mail：934663287@qq.com

李異玲,博士，教授，主任醫師，碩士生導師，研究方向：非酒精性脂肪性肝病的基礎與臨床。E-mail：lyl-72@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.04.006

R575.5

A

1006-5709(2016)04-0382-04

2015-09-25