丹酚酸B對大鼠缺血心肌組織溶酶體功能的影響

孫帥軍　王新宇　黃小玲　陳葉香　王　曼　蔣寶平　許　立

(南京中醫藥大學藥學院，江蘇　南京　210023)

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·基礎研究·

丹酚酸B對大鼠缺血心肌組織溶酶體功能的影響

孫帥軍王新宇黃小玲陳葉香王曼蔣寶平1許立1

(南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京210023)

〔摘要〕目的探討丹酚酸B(Sal B)對異丙腎上腺素(ISO)所致大鼠心肌缺血模型心肌溶酶體功能的影響。方法SD大鼠隨機分為空白組，模型組，丹參注射液組和Sal B 12.8、6.4、3.2 mg/kg組。除空白組外，各組大鼠尾靜脈注射ISO建立急性心肌缺血模型，連續給藥7 d后，PowerLab數據采集分析系統測定各組大鼠心電圖變化;試劑盒測定血清中溶酶體相關膜蛋白2(Lamp-2)、組織蛋白酶D(Cat-D)的活性，心臟勻漿中一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、Cat-D和溶酶體勻漿中Cat-D的活性;HE染色法檢測心肌梗死面積。結果與空白對照組比較(P<0.05或P<0.01)，模型組大鼠心電圖T波水平顯著升高，血清中Lamp-2、Cat-D的水平顯著升高，心臟勻漿中NOS、NO、Cat-D含量升高，溶酶體勻漿中Cat-D含量降低，心肌梗死面積明顯增多。Sal B 12.8、6.4 mg/kg組和丹參注射液組能夠顯著降低心電圖T波升高值，降低血清lamp2、Cat-D和心臟勻漿中NOS、NO、Cat-D含量,升高心臟溶酶體勻漿Cat-D含量，與模型組比較(P<0.05或P<0.01)。結論Sal B對心肌缺血的保護作用與溶酶體的膜穩定性及水解酶的活性功能有一定的關系。

〔關鍵詞〕丹酚酸B；心肌缺血；溶酶體；組織蛋白酶D

心肌缺血主要由血壓降低、主動脈供血減少、冠狀動脈阻塞等導致〔1〕。丹參注射液具有活血化瘀、通絡止痛的功效，主要用于治療冠心病心絞痛、心肌梗死等疾病〔2〕。丹酚酸B(Sal B)是丹參的水溶性有效成分，本課題組前期研究發現其對心肌缺血、動脈粥樣硬化等疾病有保護作用，主要機制為抗氧化和清除自由基等〔3〕。心肌受損時，溶酶體在胞內發揮維持新陳代謝及細胞功能活性等作用。本實驗主要探討心肌受損時Sal B對大鼠急性心肌缺血的保護作用及與溶酶體功能的相關性。

1材料與方法

1.1藥品與試劑Sal B(南京先慧醫藥工程研究有限公司，批號13091310)，異丙腎上腺素(ISO,sigma公司,批號Lot#SLBG3431V)，丹參注射液(正大青春寶藥業有限公司,批號1309233)，氯化鈉注射液(江蘇亞邦生緣藥業有限公司,批號13052402)，溶酶體相關膜蛋白2(Lamp-2)試劑盒、組織蛋白酶D(CatD)試劑盒、一氧化氮(NO)試劑盒、一氧化氮合酶(NOS)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號201505)。

1.2儀器Power-Lab 6.0數據采集分析系統(澳大利亞AD Instrument),FA1204B型分析天平(上海精科天美科學儀器有限公司)，Synergy HT型酶標儀(美國Bio-Tek公司)，CKX31型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)，Allegra 64R型冷凍離心機(美國Beckman-Coulter公司)。

1.3動物健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，清潔級，60只，雌雄各半，體重180～220 g，采購自揚州大學實驗動物中心〔SXCK(蘇)：2014-0105〕。飼養在南京中醫藥大學實驗動物中心，室溫18℃～22℃，濕度50%～60%。

1.4實驗方法將大鼠隨機分為空白組，模型組，丹參注射液組，Sal B 12.8、6.4、3.2 mg/kg組，每組10只。Sal B各組大鼠分別每日尾靜脈注射Sal B 12.8、6.4、3.2 mg/kg，連續7 d；丹參注射液組大鼠每日尾靜脈注射丹參注射液4 000 mg/kg連續7 d，模型組和空白組每日給予等量生理鹽水。各組以2 ml/kg體積尾靜脈注射藥物。末次給藥后除空白組外，尾靜脈注射ISO 5 mg/kg，2次/d，連續2 d。ISO造模后第3天，大鼠禁食不禁水12 h，描記描記大鼠1、3、5、10、15、20、30 min心電圖(ECG)，記錄S-T段的變化，若具備以下條件之一者判斷為造模成功：①ST段水平向下或向上偏移≥0.1 mV；②T波高聳超過同導聯R波的1/2；③T波高聳伴ST段移位。心電圖記錄完畢后，頸動脈插管取血，于高速冷凍離心機3 000 r/min離心10 min，離心后取血清，-20℃凍存，備用。摘取心臟，石蠟包埋，切成4 μm石蠟切片，蘇木素-伊紅(HE)染色后顯微鏡下觀察組織病理學變化。

1.5心肌酶學指標的檢測取心臟，以冰生理鹽水洗去殘留血液，濾紙吸干后切下約2 mm的心尖部分，制成10%的生理鹽水心肌組織勻漿，部分以3 000 r/min離心10 min，取上清-20℃凍存，備用。取部分心肌組織勻漿高速離心，2 500 r/min離心10 min分離出結構蛋白、細胞核、細胞碎片，7 200 r/min離心10 min分離出線粒體；13 000 r/min離心10 min分離出溶酶體，制備分離出溶酶體勻漿。取上清-20℃凍存，備用。按試劑盒操作說明測定心臟勻漿中NOS、NO、Cat-D和溶酶體勻漿中Cat-D的活性。

1.6統計學方法應用SPSS17.0軟件，實驗數據用x±s表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。

2結果

2.1一般情況觀察空白組大鼠精神狀態良好，飲食規律且正常，活動狀況良好。模型組大鼠飲食較少，精神狀態差。各用藥組大鼠較模型組精神狀態相對有所改善，食量基本正常，活動情況較模型組也有改善。

2.2ECG的檢測空白組、丹參注射液組與模型組比較，1～30 min時間段內，各個不同的時間點T波抬高值均降低(P<0.05或P<0.01)。Sal B 12.8、6.4 mg/kg組與模型組比較，在3～20 min時間段，T波抬高值均降低(P<0.05或P<0.01)。Sal B 3.2 mg/kg組與模型組比較，在10、20 min處，T波抬高值均降低(P<0.05或P<0.01)。在其余各時間段Sal B 12.8、6.4、3.2 mg/kg組與模型組比較雖有降低的趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。Sal B 12.8 mg/kg組與丹參注射液組作用相近。見表1。

表1Sal B對急性心肌缺血大鼠ECG T波抬高值的影響(x±s，n=10,mV)

組別劑量(mg/kg)即刻1min3min5min10min15min20min30min空白組-0.05±0.010.05±0.011)0.05±0.010.06±0.021)0.05±0.012)0.05±0.011)0.06±0.011)0.05±0.011)模型組-0.05±0.020.06±0.030.09±0.060.08±0.020.08±0.020.09±0.050.11±0.050.14±0.04丹參注射液組40000.04±0.010.05±0.021)0.05±0.011)0.05±0.012)0.05±0.012)0.05±0.011)0.05±0.021)0.06±0.012)SalB組12.80.05±0.010.05±0.010.04±0.011)0.05±0.012)0.05±0.012)0.05±0.020.06±0.031)0.06±0.012)SalB組6.40.05±0.020.05±0.020.05±0.021)0.05±0.022)0.05±0.012)0.05±0.011)0.05±0.022)0.10±0.02SalB組3.20.05±0.020.06±0.020.07±0.030.08±0.050.06±0.021)0.06±0.020.05±0.021)0.10±0.04

與模型組比較：1)P<0.05,2)P<0.01，下表同

2.3血清酶學指標的檢測空白組、丹參注射液組、Sal B 12.8、6.4 mg/kg組與模型組比較，血清中Lamp-2、Cat-D濃度顯著下降(P<0.05或P<0.01)；Sal B 3.2 mg/kg組與模型組比較無顯著性差異。見表2。

2.4心肌酶學指標的檢測空白組、丹參注射液組、Sal B 12.8、6.4 mg/kg組與模型組比較，組織勻漿中NO、NOS濃度顯著升高，Cat-D濃度顯著下降，心臟溶酶體勻漿中Cat-D濃度顯著升高(P<0.05或P<0.01)；Sal B 3.2 mg/kg組與模型組比較無顯著性差異。見表2，表3。

表2Sal B對血清中Lamp-2、Cat-D含量的影響(x±s，n=10)

組別劑量(mg/kg)血清Lamp-2(pg/ml)Cat-D(ng/ml)心臟溶酶體勻漿Cat-D(ng/ml)空白組-0.13±0.022)3.45±2.352)35.93±3.752)模型組-0.17±0.0417.09±3.7929.29±6.24丹參注射液組40000.13±0.022)12.44±4.051)36.40±5.281)SalB組12.80.14±0.022)14.00±2.301)37.88±4.512)SalB組6.40.14±0.021)15.67±3.1531.78±4.59SalB組3.20.14±0.0216.06±3.3430.25±4.86

表3Sal B對心臟勻漿中NO、NOS、Cat-D含量的影響(x±s，n=10)

組別劑量(mg/kg)NOS(μmol/L)NO(μmol/L)Cat-D(ng/ml)空白組-28.47±1.252)28.56±4.312)3.45±2.352)模型組-19.96±1.1818.05±3.6817.09±3.79丹參注射液組400026.60±2.412)25.84±2.562)12.44±4.051)SalB組12.825.91±1.432)24.521±3.481)14.00±2.301)SalB組6.423.87±2.612)22.63±2.171)15.67±3.15SalB組3.222.09±1.551)20.26±3.9016.06±3.34

2.5Sal B對急性心肌缺血大鼠病理組織學的影響空白組大鼠心臟心肌細胞橫紋清晰，未見增生肥大、萎縮、斷裂，無細胞變性、壞死等病變，間質無水腫及炎性細胞浸潤，心外膜、心內膜無異常；模型組8例心臟可見局灶性大量心肌纖維重度變性壞死、大量炎細胞浸潤，余2例心臟可見局灶性心肌纖維變性壞死、中度炎細胞浸潤；丹參注射液組9例可見局灶性心肌纖維輕度變性壞死、少量炎細胞浸潤，1例局灶性心肌纖維變性壞死、中度炎細胞浸潤；Sal B 12.8 mg/kg組8例心臟可見局灶性心肌纖維輕度變性壞死、少量炎細胞浸潤，2例局灶性心肌纖維變性壞死、中度炎細胞浸潤；6.4 mg/kg組3例心臟可見大量心肌纖維重度變性壞死、大量炎細胞浸潤，7例局灶性心肌纖維變性壞死、輕中度炎細胞浸潤；3.2 mg/kg組5例心臟可見大量心肌纖維重度變性壞死、大量炎細胞浸潤，5例局灶性心肌纖維變性壞死、輕中度炎細胞浸潤。見圖1。

空白組、丹參注射液組、Sal B 12.8 mg/kg組與模型組比較，心肌纖維變性壞死、炎細胞浸潤差異顯著(P<0.05或P<0.01)。見表4。

圖1　Sal B對急性心肌缺血大鼠病理組織學影響

表4Sal B對急性心肌缺血大鼠病理評分的影響(n，n=10)

組別劑量(mg/kg)心肌纖維變性壞死ⅠⅡⅢⅣ炎細胞浸潤ⅠⅡⅢⅣ空白組2)-1000010000模型組000820082丹參注射液組2)400009100910SalB組2)12.808200820SalB組6.403430343SalB組3.202350235

3討論

ECG中T波的上升程度以及ST波段的改變可以反映心肌缺血和心肌損傷的嚴重程度。Sal B可擴張冠狀動脈，增加側支循環、降低冠脈阻力，使其在心排出量不增加的前提下增加冠脈血流量、提高心肌血流量，改善缺血區的供血供氧，維持心臟作用〔4〕。本實驗在注射ISO后，可明顯發現T波上移、ST波段顯著性下降；病理組織染色發現，ISO注射后心肌纖維重度變性壞死，明顯空泡變性及大量炎性細胞浸潤；而在給予Sal B 12.8、6.4 mg/kg后心電圖T波變化、病理損傷有顯著改善。

ISO誘導心肌受損，產生的氧自由基等引起血管內皮受損，從而抑制NOS活性。NO由NOS催化完成，通過抑制超氧陰離子和脂質過氧自由基所引起的過氧化損傷，對缺血后心功能的恢復及預后具有重要作用〔5〕。研究發現Sal B能夠提高內皮細胞eNOS的表達，適度地活化iNOS，促進NO的合成〔6〕。本實驗表明Sal B的心肌保護作用與氧自由基清除有關。

心肌受損產生過量的活性氧及自由基可誘發溶酶體膜通透性增加，影響溶酶體功能進而導致細胞死亡。溶酶體內含組織蛋白酶在內的多種高濃度酸性水解酶，這些水解酶可將與溶酶體融合的吞噬小泡所含的物質降解成小分子，從而維護機體的正常生理代謝〔7〕。心肌受損時，溶酶體在凋亡信號的作用下，激活溶酶體內Cat-D、Cat-B等水解酶的活性，通過減少細胞內炎癥因子等，從而發揮保護細胞的功能〔8〕。Conus等〔9〕研究表明，細胞受損時，溶酶體釋放了大量Cat-D、Cat-G等Cat，Cat-D通過激活caspase-8誘導中性粒細胞凋亡，減輕炎癥反應。在心肌受損時，Cat-D等水解酶從細胞內的溶酶體內大量釋放入胞外，因此，病理條件下Cat-D在組織和血清高表達。Lamps覆蓋在溶酶體膜表面，是穩定溶酶體膜蛋白及膜結構完整性的重要蛋白〔10〕。番茄紅素等能夠對ISO所致的心肌受損大鼠發揮保護作用，認為其主要通過穩定溶酶體膜。保護溶酶體功能，進而發揮清除自由基、抗氧化等抗炎作用，保護心肌細胞〔11〕。Kreuzaler等〔12〕應用siRNA技術去除Lamp-2后溶酶體膜的通透性增加，導致溶酶體的完整性破壞和細胞的死亡。總之，本實驗表明，Sal B對心肌缺血的保護作用與溶酶體的膜穩定性及水解酶的活性有關。

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〔2015-12-25修回〕

(編輯袁左鳴)

Protective effects of salvianolic acid B on lysosomal dysfunction in isoproterenol induced myocardial ischemic rats

SUN Shuai-Jun，WANG Xin-Yu，HUANG Xiao-Ling，et al.

Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,Jiangsu,China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the protective effects of salvianolic acid(Sal) B on lysosomal dysfunction in isoproterenol induced myocardial ischemic rats.MethodsAll rats were randomly divided into control,model,Salvia miltiorrhiza injection and Sal B 12.8,6.4,3.2 mg/kg groups.The effects of Sal B on the electrocardiogram(ECG) at different time points were observed.The serum levels of lysosomal-associated membrane protein(lamp)-2 and cathepsin(cat)-D were measured.Also the levels of cat-D,nitric oxide(NO),nitric oxide synthase(NOS) in homogenate of myocardial tissue and cat-D in lysosomal homogenate of myocardial tissue were tested.Meanwhile,the myocardial tissue pathological changes were observed.ResultsThe levels of Lamp-2 and Cat-D in serum,NOS,NO and Cat-D in homogenate of myocardial tissue of model group were increased;and the level of Cat-D in lysosomal homogenate of myocardial tissue was reduced(P<0.05 or P<0.01) compared with those of control group.The contents of Lamp-2 and Cat-D in serum,NOS,NO and Cat-D in homogenate of myocardial tissue were decreased in Sal B 12.8,6.4 mg/kg and Salvia miltiorrhiza injection groups;and the level of Cat-D in lysosomal homogenate of myocardial tissue was increased compared with that of model group(P<0.05 or P<0.01).ConclusionsSal B has protective effects on myocardial ischemic rats,its mechanism might be related with the function of hydrolytic enzymes and lysosomal membrane stability.

【Key words】Salvianolic acid B;Myocardial ischemia;Lysosome;Cathepsin D

〔中圖分類號〕R28

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1789-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.001

通訊作者：許立(1964-)，男，教授，碩士生導師，主要從事中藥藥理研究。

基金項目：國家十二五重大新藥創制科技重大專項(No.2011ZX09102-002-07)

1江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室

第一作者：孫帥軍(1989-)，男，碩士，主要從事中藥藥理研究。