蒙藥嘎日迪烏日勒對腦缺血再灌注損傷的保護作用及對一氧化氮、一氧化氮合酶、腦源性神經營養因子、血管內皮生長因子的影響

巴圖德力根　韓志強　王　茜　孫曉成　安　達

(內蒙古民族大學附屬醫院蒙藥臨床藥理研究所,內蒙古　通遼　028007)

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蒙藥嘎日迪烏日勒對腦缺血再灌注損傷的保護作用及對一氧化氮、一氧化氮合酶、腦源性神經營養因子、血管內皮生長因子的影響

巴圖德力根韓志強王茜1孫曉成2安達

(內蒙古民族大學附屬醫院蒙藥臨床藥理研究所,內蒙古通遼028007)

〔摘要〕目的探討蒙藥嘎日迪烏日勒對腦缺血再灌注損傷的保護作用及對一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、腦源性神經營養因子(BDNF)、血管內皮生長因子(VEGF)的影響。方法SD大鼠分為假手術組、模型組、陽性組、嘎日迪烏日勒低、高劑量組，每組20只，10只用于腦梗死面積百分比測定,10只用于腦勻漿中NO、神經型一氧化氮合酶(nNOS)、VEGF及BDNF含量測定。嘎日迪烏日勒低、高劑量組分別給予灌胃嘎日迪烏日勒0.18、0.36 g/kg，陽性組給予金納多片0.16 g/kg，1次/d,連續給藥7 d。再灌注24 h后處死大鼠，取腦，進行TTC染色計算腦梗死面積，HE染色觀察腦組織病理改變；制備10%的腦組織勻漿，檢測NO、nNOS、VEGF及BDNF含量。結果與假手術組比較，其他組腦梗死面積明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性組、嘎日迪烏日勒高、低劑量組腦梗死面積明顯降低(P<0.05)。HE染色，給藥組正常腦組織結構消失，椎體細胞體積縮小，部分椎體細胞脫失、壞死、組織稀疏，間質水腫，與梗死區邊界模糊。與假手術組比較，模型組、嘎日迪烏日勒低、高劑量組NO、nNOS、BDNF、VEGF均明顯升高(P<0.05)；陽性組NO、nNOS、VEGF明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，陽性組、嘎日迪烏日勒低、高劑量組NO、nNOS明顯降低，嘎日迪烏日勒低劑量組BDNF明顯升高、VEGF明顯降低(P<0.05)。結論嘎日迪烏日勒對腦缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用，其機制可能與調節腦組織中NO、nNOS、BDNF、VEGF的含量有關。

〔關鍵詞〕嘎日迪烏日勒；腦缺血再灌注損傷

蒙藥嘎日迪烏-13，蒙古名扎沖十三味丸，由訶子、制草烏、石菖蒲、木香、人工麝香、珊瑚(制)、珍珠(制)、丁香、肉豆蔻、沉香、禹糧土、磁石(煅)、甘草等藥材組成；功能祛風通竅，舒筋活血，鎮靜安神，除“協日烏素”。用于半身不遂，左癱右瘓，口眼歪邪，四肢麻木，腰腿不利，言語不清，筋骨疼痛，神經麻痹，風濕，關節疼痛。收載于1998年版衛生部藥品標準(蒙藥分冊)〔1〕。嘎日迪-13味丸在各蒙醫醫院和蒙藥生產企業的制備工藝均有所不同。國家“十二五”支撐計劃課題研究組查閱相關文獻，并咨詢蒙醫醫院臨床醫生、院內制劑室工藝專家，蒙藥生產企業工程師，蒙醫院校蒙藥方劑、制劑、工程專家，最終達成共識，確定了最終制備工藝參數，命名為“嘎日迪烏日勒”。研究表明，嘎日迪-13味丸對腦缺血再灌注損傷具有保護作用，機制可能與調節神經元特異性烯醇化酶(NSE)、白細胞介素(IL)-1 、腫瘤壞死因子(TNF)-α含量有關〔2〕。本課題研究嘎日迪烏日勒對腦缺血再灌注損傷的保護作用及對一氧化氮(NO)、NO合酶(NOS)、腦源性神經營養因子(BDNF)、血管內皮生長因子(VEGF)的影響，為蒙藥嘎日迪烏日勒治療 “薩病”提供依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器XTS-4A型手術顯微鏡，江蘇鎮江中天光學儀器有限責任公司；AUW120D電子天平(0.000 01 g)，日本島津制作所試驗計測事業部；DW-GL218型低溫冰箱，北京中科美菱低溫科技有限責任公司；BG10-3A高速冷凍離心機，北京時代北利離心機有限公司；DY89-2電動玻璃勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司；Image-Pro Plus 6.0專業圖像分析系統，美國Media Cybernetics公司；萊卡DM2500顯微鏡，德國萊卡。

1.1.2主要藥品嘎日迪烏日勒：內蒙古民族大學附屬醫院蒙藥制劑室；金納多片：德國威瑪舒培博士大藥廠，每片含有銀杏葉提取物40 mg，其中銀杏黃酮苷9.6 mg，萜類內酯2.4 mg(銀杏內酯、白果內酯)，批準文號：p0090296 Dr.Willmar Schwabe GmbH & Co.KG 86978378000147。

1.1.3試劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)試劑，北京拜爾迪生物技術有限公司。NO、NOS(nNOS)、VEGF、BDNF酶聯免疫試劑盒，購自上海滬尚生物科技有限公司。

1.1.4實驗動物SPF級健康雄性SD大鼠，體重200～220 g，由遼寧省長生生物技術有限責任公司提供，生產許可證號：SCXK(遼)-2010-0001。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組、給藥、造模方法〔3〕SD大鼠，按體重隨機分為假手術組、模型組、金納多陽性組、嘎日迪烏日勒低、高劑量組，每組20只，10只用于腦梗死面積百分比測定,10只用于腦勻漿中NO、nNOS、VEGF及BDNF含量測定。嘎日迪烏日勒低、高劑量組，分別給予灌胃嘎日迪烏日勒0.18、0.36 g/kg，陽性組給予金納多片0.16 g/kg，均按20 ml/kg體積灌胃給藥，假手術組及模型組予等容積0.5%纖維素鈉混懸液，1次/d,連續給藥7 d。給藥7 d后禁食、不禁水12 h，10%水合氯醛(3.0 ml/kg)腹腔注射麻醉，參照Longa等〔4〕的線栓法略加改良，制備大鼠大腦中動脈閉塞模型(MCAO)。對大鼠大腦中動脈閉塞模型進行神經功能缺失評分：0分，沒有神經功能缺損，1分(不能完全伸展對側前爪)為輕度局灶性神經功能缺損，2分(向對側轉圈)為中度的局灶性神經功能缺損,3分(向對側傾倒)為重度的局灶性神經功能缺損，4分為大鼠沒有自發地行走，并且意識喪失。達到1～3分者納入研究。

1.2.2腦梗死面積百分比測定再灌注24 h后取各組存活大鼠麻醉(10%水合氯醛3.0 ml/kg)，抽出全身血液，快速斷頭取腦。將所取大鼠腦組織置于-20℃低溫冰箱20 min，取出后由前向后迅速均勻切片(間隔約1.5～2 mm)，切片置于新配制的含1%TTC的磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.4)中，37℃避光置于恒溫水箱10 min(隔5 min翻動腦片1次，以確保染色均勻)，在10%中性甲醛溶液中固定。用數碼相機雙面拍攝染色后腦片，傳輸至計算機，運用Image-Pro Plus 6.0專業圖像分析系統分析腦梗死面積百分比。

1.2.3腦組織勻漿的制作及腦勻漿中NO、nNOS、VEGF及BDNF含量測定再灌注24 h后取各組存活大鼠麻醉(10%水合氯醛3.0 ml/kg)，抽出全身血液，快速進行斷頭取腦，冰PBS沖洗，除去血液后在手術顯微鏡下去掉腦膜及血管，在冷PBS中漂洗，濾紙拭干，在大腦中動脈缺血梗死區及缺血梗死區周圍半暗帶區取腦組織，用預冷的0.1 mmol/L pH7.4 PBS，制成10%腦組織勻漿,4℃，3 000 r/min離心8 min收集上清液，分裝后放于-80℃保存備用。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測腦組織勻漿中NO、nNOS、VEGF及BDNF含量。

1.3統計學方法應用SPSS17.0軟件行多組方差分析。

2結果

2.1腦梗死面積百分比測定結果與假手術組(0)比較，其他組腦梗死面積明顯升高(P<0.05)。與模型組(0.26±0.017)比較，陽性組(0.21±0.027)、嘎日迪烏日勒高、低劑量組(0.20±0.030)、(0.21±0.047)腦梗死面積明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2腦組織勻漿中NO、nNOS、VEGF及BDNF含量測定與假手術組比較，模型組、嘎日迪烏日勒低、高劑量組NO、nNOS、BDNF、VEGF含量均明顯升高(P<0.05)；陽性組NO、nNOS、VEGF明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，陽性組、嘎日迪烏日勒低、高劑量組NO、nNOS明顯降低，嘎日迪烏日勒低劑量組BDNF明顯升高、VEGF明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1各組腦組織NO、nNOS、BDNF、VEGF含量比較表(x±s，n=10)

組別NO(μmol/L)nNOS(ng/ml)BDNF(ng/ml)VEGF(ng/L)假手術組14.87±5.632.06±0.641.49±0.47294.16±101.18模型組53.15±5.081)3.68±0.151)1.60±0.461)528.76±58.771)陽性組43.75±12.151)2)3.35±0.411)2)1.57±0.60499.56±68.271)嘎日迪烏日勒低劑量組43.90±11.091)2)3.28±0.481)2)2.01±0.281)2)454.31±78.571)2)嘎日迪烏日勒高劑量組41.73±14.931)2)3.32±0.341)2)1.94±0.251)453.15±75.161)2)

與假手術組比較：1)P<0.05，與模型組比較：2)P<0.05

2.3腦組織蘇木素-伊紅(HE)染色結果假手術組HE染色可見神經元、膠質細胞及毛細血管形態正常，結構完整，包膜核膜清晰，椎體細胞核大而圓，核仁明顯。模型組可見明顯梗死灶，正常腦組織結構消失，椎體細胞體積縮小，細胞質嗜伊紅，細胞核呈三角形固縮濃染，部分椎體細胞脫失、壞死、組織稀疏，間質水腫，較多炎性細胞改變的神經元和形態正常的神經元交錯存在，主要位于基底節內側及額頂葉皮質的上部，與梗死區邊界清楚。給藥組與模型組相比梗死灶面積相對較小，正常腦組織結構消失，椎體細胞體積縮小，部分椎體細胞脫失、壞死、組織稀疏，間質水腫，與梗死區邊界模糊。見圖2。

A：假手術組；B：模型組；C：陽性組；D：嘎日迪烏日勒低劑量組；E：嘎日迪烏日勒高劑量組；下圖同圖1　腦組織切片TTC染色

圖2　腦組織病理切片HE染色

3討論

本實驗結果表明，嘎日迪烏日勒能明顯降低腦缺血再灌注后腦梗死面積。在腦缺血再灌注損傷中，NO可能扮演著雙重角色，即神經保護和神經毒性，生理量的NO具有保護作用，而高濃度則有明顯的神經毒性〔5〕，nNOS可能介導了再灌注后早期神經元損傷〔6〕。本研究表明嘎日迪烏日勒對腦缺血再灌注損傷的保護作用可能與降低 nNOS和NO有關。

VEGF可被缺氧所誘導〔7〕，而在腦梗死時，腦水腫的形成先于血管生成〔8〕。Kovacs等〔9〕研究發現，早期階段(18 h～2 d)梗死邊緣和核心的巨噬細胞成為VEGF的第一個主要來源，而神經元的VEGF從損傷后的18 h～5 d在核心區，并且至10 d在邊緣區可被檢測到。雖然VEGF對損傷后腦組織的血管再生及神經保護有一定的作用，然而VEGF增加血管通透性的作用又可能是加重腦缺血再灌注損傷后引起腦水腫的一個重要原因。對于腦組織來說，腦水腫可能是致命的并發癥，因腦組織廣泛的水腫可能會引起顱內壓增高形成腦疝而危及生命。本實驗也進一步驗證了VEGF可被缺氧所誘導，嘎日迪烏日勒可通過降低血管通透性，減輕腦缺血再灌注損傷。

BDNF主要存在于中樞神經系統，其作用廣泛，包括抗凋亡、調節局部炎癥，保護大腦對抗缺血損傷、抗TMT誘導的神經毒性、在體外增加神經的形成；在體內可促進暫時性腦缺血損傷模型的腦恢復〔10〕等功能。本研究表明嘎日迪烏日勒低劑量組能夠明顯升高腦組織中BDNF含量，而起到保護腦缺血再灌注損傷的作用。

綜上所述，嘎日迪烏日勒對腦缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用，其機制可能與調節腦組織中NO、nNOS、BDNF、VEGF的含量有關。

4參考文獻

1中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準(蒙藥分冊)〔S〕.1998:70.

2陶春,林琳,宋葆華,等.蒙藥嘎日迪-13味丸對腦缺血大鼠海馬組織白介素-1β、腫瘤壞死因子-α蛋白及神經細胞凋亡的影響〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(1):152-4.

3田彩云,張浩楠,何靜波,等.嘎日迪-13對局灶性腦缺血大鼠NSE、TNF-α、IL-6表達的影響〔J〕.中草藥,2015;46(5):716-20.

4Longa EZ,Weinstein PR,Carlon S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats 〔J〕.Stroke,1989;20(1):84-91.

5Calabrese V,Mancuso C,Calrani M,etal.Nitric oxide in the central nervous system:neuroprotection versus neurotoxicity 〔J〕.Nat Rev Neurosci,2007;8(10):766-75.

6Samdani AF,Dawson TM,Dawson VL,etal.Nitric oxide synthase in models of focal ischemia 〔J〕.Stroke,1997;28(6):1283-8.

7Mukhopadhyay D,Tsiokas L,Zhou XM,etal.Hypoxic induction of human vascular endothelial growth factor expression through c-Src activation〔J〕.Nature,1995;375(6532):577-81.

8Liu HM.Neovasculature and blood-brain barrier in ischemic brain infarct 〔J〕.Acta Neuropathol,1988;75(4):422-6.

9Kovacs Z,Ikezaki K,Samoto K,etal.VEGF and flt:expression time kinetics in rat brain infarct 〔J〕.Stroke,1996;27(10):1865-72.

10Zhu JM,Zhao YY,Chen SD,etal.Functional recovery after transplantation of neural stem cells modified by brain-derived neurotrophic factor in rats with cerebral ischaemia〔J〕.J Int Med Res,2011;39(2):488-98.

〔2015-12-11修回〕

(編輯袁左鳴)

Protective effects of traditional Mongolian medicine Ga-Ri-Di-Wu-Ri-Le on cerebral ischemia-reperfusion and influences on the levels of NO,NOS,BDNF and VEGF

Ba Tu-de-li-gen，HAN Zhi-Qiang,WANG Qian，et al.

Institute of Clinical Pharmacology of Traditional Mongolian Medicine,Affiliated Hospital of Inner Mongolia University for the Nationalities,Tongliao 028007,Inner Mongolia Autonomous Region,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the protective effects of traditional Mongolian medicine on cerebral ischemia-reperfusion and influences on the levels of NO,NOS,BDNF,VEGF.MethodsThe SD rats were divided into sham,model,Ginaton,Ga-Ri-Di-Wu-Ri-Le low and high dose groups.10 rats were used to evaluate infraction area percentage,10 rats were used to detect the levels of NO,nNOS,VEGF and BDNF of brain tissue homogenize.ResultsThe infraction area of sham group was significantly increased compared with that of other groups(P<0.05);compared with that of model group,the infraction areas of Ginaton,Ga-Ri-Di-Wu-Ri-Le high and low dose groups were significantly decreased(P<0.05).The normal histological structures of drug treated groups were disappeared,the volume of pyramidal cells were reduced,same pyramidal cells were dropped out or necrotized,the tissues were sparse and interstitial edema were observed,the edges of infraction area were blurred,the pathological changes were significantly milder than those of model group.Compared with those of sham group,the levels of NO,NOS,BDNF,VEGF in model,Ga-Ri-Di-Wu-Ri-Le low and high dose groups were significantly increased(P<0.05);NO,NOS,VEGF contents of Ginaton group were significantly increased(P<0.05).Compared with those of model group,the NO,NOS contents of Ginaton,Ga-Ri-Di-Wu-Ri-Le low and high dose groups were significantly decreased(P<0.05),the BDNF and VEGF contents of Ga-Ri-Di-Wu-Ri-Le low dose group were significantly increased(P<0.05).ConclusionsThe Ga-Ri-Di-Wu-Ri-Le has significant protective effects on cerebral ischemia-reperfusion injury,its mechanism might related with regulation of levels of NO,nNOS,BDNF,VEGF of brain tissues.

【Key words】Traditional Mongolian medicine Ga-Ri-Di-Wu-Ri-Le;Cerebral ischemia-reperfusion injury

〔中圖分類號〕R74

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1792-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.002

基金項目：國家科技支撐計劃基金資助項目(No.2012BAI27B02)

1通遼市人民醫院

2內蒙古民族大學臨床醫學院

第一作者：巴圖德力根(1969-)，男，碩士，教授，碩士生導師，主要從事蒙藥藥理研究。