SB431542對高糖環境中小鼠足細胞Cdk5/p35表達的影響

李宏博　張　悅　郝　軍　趙　松　劉　巍

(河北醫科大學病理學教研室，河北　石家莊　050017)

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SB431542對高糖環境中小鼠足細胞Cdk5/p35表達的影響

李宏博張悅1郝軍趙松劉巍

(河北醫科大學病理學教研室，河北石家莊050017)

〔摘要〕目的應用SB431542及Roscovitine處理高糖培養的足細胞，觀察抑制轉化生長因子(TGF)-β1通路對高糖培養足細胞中Cdk5/p35表達的影響及抑制Cdk5激酶活性對高糖和TGF-β1誘導足細胞凋亡的影響。方法采用不同濃度SB431542(0.1，1.0，10 μmol/L)處理高糖培養的足細胞，Western印跡法及RT-PCR技術檢測各處理組Cdk5及p35蛋白和mRNA的表達變化情況。應用流式細胞術檢測Roscovitine對高糖及TGF-β1刺激足細胞凋亡的影響。結果高糖(HG組)Cdk5和p35的蛋白及mRNA表達水平明顯增高，顯著高于正常血糖組(NG)組和甘露醇組(M組)(P<0.05)，并且呈時間依賴性升高。加入SB431542后，高糖培養導致的足細胞內Smad-2蛋白磷酸化水平明顯降低。同時，HG+SB431542組足細胞內Cdk5和p35的蛋白及mRNA表達水平呈濃度依賴性顯著降低，明顯低于HG組(P<0.05)。加入Roscovitine后，高糖及TGF-β1誘導足細胞的足細胞凋亡水平顯著下降(P<0.05)。結論高糖可能通過活化TGF-β1通路上調Cdk5/p35表達從而誘導足細胞凋亡。

〔關鍵詞〕糖尿病腎病；足細胞；高糖；轉化生長因子-β1；Cdk5；p35

足細胞的損傷在糖尿病腎病(DN)的進展中發揮了重要作用〔1〕。細胞周期素依賴性蛋白激酶5(Cdk5)是細胞周期素依賴性蛋白激酶家族成員之一，屬于脯氨酸限定性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過與其特異性的調節蛋白p35或p39結合而被激活。腎組織中，Cdk5主要表達于終末分化的足細胞中，對調控足細胞的增殖、分化和形態結構具有重要作用。最新研究顯示，Cdk5/p35的表達水平在高糖刺激的足細胞中顯著升高，并同足細胞凋亡密切相關〔2〕。但是，高糖通過何種途徑引起足細胞中Cdk5/p35表達升高并不十分清楚。轉化生長因子(TGF)-β1刺激可導致神經元中Cdk5/p35蛋白的表達及活性增高，從而影響疼痛信號的傳導〔3，4〕。高糖是否可通過TGF-β1通路增加足細胞中Cdk5/p35的表達從而誘導足細胞凋亡，尚未見報道。因此，本研究擬通過培養條件性永生化足細胞，應用轉化生長因子受體1抑制劑SB431542處理高糖培養的足細胞，觀察抑制TGF-β1通路對高糖培養足細胞中Cdk5/p35表達的影響；應用Cdk5激酶活性抑制劑Rocovitine處理高糖及TGF-β1培養的足細胞，觀察抑制Cdk5激酶活性對足細胞凋亡的影響。

1材料與方法

1.1材料條件性永生化小鼠足細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心。Cdk5抗體購自美國Epitomics公司，p35抗體購自美國Santa Cruz公司，β-actin、p-Smad-2購自美國SAB公司。SB431542和Ⅰ型膠原蛋白購自美國Sigma公司。DMEM培養基購自美國Gibco公司。重組人TGF-β1細胞因子、重組小鼠γ-干擾素(γ-IFN)購自美國PeproTech公司。SYBR?Premix Ex TaqTMReal-time PCR試劑盒購自大連寶生物公司。Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養條件性永生化小鼠足細胞培養方法參照文獻報道〔5〕。培養時，培養瓶及培養板底部均預先鋪被0.1 mg/ml的Ⅰ型膠原蛋白。未分化足細胞用含有10% 胎牛血清(FBS)、20 U/ml γ-IFN、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基在33℃，5%CO2培養箱中培養，促進細胞增殖傳代(許可條件)。許可條件下培養的足細胞按1∶10傳代后，在37℃，用不添加γ-IFN的DMEM培養基(含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)培養10～15 d(非許可條件)，誘導足細胞分化成熟。

1.2.2實驗分組足細胞在無血清培養基培養24 h后，按如下分組：①正常糖組(5.5 mmol/L，NG組)；甘露醇組(24.5 mmol/L，M組)；高糖組(30 mmol/L，HG組)。高糖組按不同刺激時間分為0、3、6、12 h。②正常糖組(NG組)；高糖組(HG組)；高糖+SB431542組(0.1、1.0、10 μmol/L，HG+SB431542組)。③對足細胞凋亡檢測的分組如下：正常糖組(NG組)；高糖組(HG組)；高糖+Roscovitine組(50 μmol/L，HG+Ros組)；TGF-β1組(10 ng/ml)；TGF-β1+Roscovitine組(TGF-β1+Ros組)。

1.2.3Western印跡法收集各組細胞提取總蛋白，每組樣品取50 μg總蛋白，加6×上樣緩沖液，100℃變性5 min，經10% SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉37℃封閉2 h，加入Cdk5(1∶100)、p35(1∶1 000)、phospho-Smad-2(1∶1 000)和β-actin(1∶2 000)抗體，4℃孵育過夜。洗膜后，加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/鼠IgG(1∶5 000)，37℃孵育2 h。洗膜后，滴加ECL試劑，于Odyssey FC圖像采集成像系統中顯影，并對條帶進行定量分析。以目的條帶和β-actin條帶積分光密度值比值作為最終結果。

1.2.4RT-PCR收集各組細胞，預冷生理鹽水漂洗3次后，采用Trizol法提取細胞總RNA。鑒定完RNA純度和完整性后，分別取1 μg總RNA用AMV逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA備用。各取2 μl逆轉錄cDNA產物作為PCR反應模板，在MX3005P Real-time PCR儀檢測Cdk5和p35的mRNA表達。Cdk5引物：上游5′-TAG GCT CTC TGA ACC CCA GT-3′，下游5′-ATC CCC ACC CGA CTC TTC-3′；p35引物：上游5′-GCC CTT CCT GGT AGA GAG CTG-3′，下游5′-GTG TGA AAT AGT GTG GGT CGG C-3′。18S引物：上游5′-ACA CGG ACA GGA TTG ACA GA-3′，下游5′-GGA CAT CTA AGG GCA TCA CAG-3′。反應擴增條件為：預變性 95℃ 30 s，95℃ 15 s，55℃ 5 s，72℃ 40 s擴增40個循環。以18S作為內參照校正，用2△△Ct法分析基因的相對表達。

1.2.5流式細胞術檢測足細胞凋亡各組實驗細胞刺激結束后，加入胰酶-EDTA消化細胞，室溫1 000 r/min，離心4 min，棄上清，加生理鹽水洗滌。向沉淀的細胞中加入已稀釋好的上樣緩沖液，500 μl/管(按1∶4用MilliQ水/滅菌蒸餾水稀釋)，反復吹打均勻；分別加入5 μl FITC標記的Annexin V和5 μl PI，混勻后避光室溫孵育10 min，立即上流式細胞儀檢測結果。

1.3統計學方法采用SPSS13.0軟件行方差分析。

2結果

2.1高糖對足細胞中Cdk5/p35表達的影響Western印跡法檢測結果顯示，HG組足細胞內Cdk5和p35的蛋白表達水平在高糖培養后有顯著增高，明顯高于NG組和M組(P<0.05，圖1)，并且隨高糖培養時間的延長逐漸增高(圖1)。RT-PCR檢測結果顯示，Cdk5和p35的mRNA表達水平在HG組呈時間依賴性顯著升高(表1)。

圖1　Western印跡法檢測各組足細胞中Cdk5/p35蛋白的表達

組別Cdk5p35NG組0.27±0.020.25±0.03M組0.24±0.030.23±0.05HG組1.28±0.191)2)1.12±0.141)2)

與NG 組比較：1)P<0.05；與M組比較：2)P<0.05

2.2SB431542對高糖刺激足細胞中Cdk5/p35表達的影響Western印跡檢測結果顯示，應用SB431542后，HG+SB431542組足細胞中phospho-Smad-2蛋白表達水平顯著降低(圖2)，提示高糖刺激引起的TGF-β1通路活化被抑制。應用SB431542后，HG+SB431542組足細胞中Cdk5和p35的蛋白表達水平有明顯降低，顯著低于NG組和HG組(P<0.05)，并與SB431542的濃度密切相關，呈濃度依賴性降低，10μmol/L SB431542的抑制效果最顯著(圖2)。定量PCR的檢測結果顯示，HG+SB431542組足細胞內Cdk5和p35的mRNA表達水平同SB431542的濃度密切相關，呈濃度依賴性降低，顯著低于NG組和HG組(P<0.05，表2)。

2.3抑制Cdk5激酶活性對高糖及TGF-β1刺激足細胞凋亡的影響高糖和TGF-β1培養足細胞后，細胞凋亡率顯著升高〔(20.01±1.72)%和(22.03±1.59)%〕，明顯高于NG組〔(5.53±0.81)%,P<0.05〕，而應用Roscovitine后，HG+ROS組和TGF-β1+ROS組足細胞的凋亡率出現降低〔(14.65±1.57)%和(17.24±1.05)%〕，顯著低于高糖和TGF-β1培養的細胞(P<0.05)。見表3～表5。

表2SB431542對高糖刺激足細胞中Cdk5/p35蛋白表達的影響(n=3，OD值，x±s)

組別Cdk5p35NG組0.24±0.050.23±0.13HG3h組0.61±0.241)0.56±0.061)HG6h組0.88±0.221)0.77±0.181)HG12h組1.14±0.161)1.09±0.111)

與NG 組比較：1)P<0.05，表3同

圖2　Western印跡檢測不同濃度SB431542處理高糖培養足細胞后Cdk5/p35蛋白的表達

組別Cdk5p35NG組1.00±0.231.00±0.11HG3h組2.12±0.251)4.56±0.541)HG6h組5.79±0.581)7.33±1.061)HG12h組9.66±0.931)12.7±1.371)

表4Cdk5/p35、p-Smad-2蛋白在各組足細胞中的

表達(n=3，OD值，x±s)

組別Cdk5p35p-Smad-2NG組0.43±0.080.27±0.060.21±0.08HG組0.83±0.110.71±0.050.62±0.03HG+SB431542(0.1μmol/L)組0.49±0.081)2)0.41±0.081)2)0.37±0.111)2)HG+SB431542(1.0μmol/L)組0.34±0.071)2)0.21±0.041)2)0.16±0.061)2)HG+SB431542(10μmol/L)組0.11±0.051)2)0.07±0.031)2)0.04±0.021)2)

與NG 組比較：1)P<0.05；與HG組比較：2)P<0.05，下表同

表5Cdk5/p35 mRNA在各組足細胞中的表達(n=3，x±s)

組別Cdk5p35NG組1.00±0.231.00±0.11HG組2.57±0.584.73±0.35HG+SB431542(0.1μmol/L)組0.93±0.181)2)0.58±0.281)2)HG+SB431542(1.0μmol/L)組0.79±0.251)2)0.68±0.141)2)HG+SB431542(10μmol/L)組0.67±0.231)2)0.41±0.111)2)

3討論

足細胞是附著于腎小球基底膜外側的高度分化的上皮細胞，同毛細血管內皮細胞、基底膜共同構成腎小球濾過屏障，對維持腎小球的正常結構和功能具有重要作用。足細胞的各種病理改變肥大、缺失、凋亡，均可導致腎小球濾過屏障的結構破壞和選擇性通透功能的進行性損傷，從而產生大量蛋白尿，并最終引起腎小球硬化和腎衰竭〔6，7〕。

Cdk5是脯氨酸限定性絲/蘇氨酸蛋白激酶，屬于細胞周期素依賴性蛋白激酶家族中的特殊成員。Cdk5主要表達于神經系統的神經元和膠質細胞中，可以通過與Cdk5調節蛋白Cdk5R1(p35)、截短型Cdk5R1(p25)或Cdk5R2(p39)結合而被激活〔8〕。最新文獻證實，Cdk5在多種非神經元細胞中發揮了重要生理功能作用，例如：胰腺β細胞、單核細胞、中性白細胞、白血病細胞、肌細胞、上皮細胞、內皮細胞、脂肪細胞等〔9〕。在胰腺β細胞中，提高細胞外的葡萄糖濃度會誘導p35表達，增強Cdk5的活性，從而影響胰島素基因的轉錄〔10〕。盡管這種調節的生理重要性還不是很清楚，但是高糖誘導的Cdk5/p35的調節異常可能是2型糖尿病病情進展過程中導致β細胞功能障礙和凋亡的病理生理機制。

在腎臟中，Cdk5主要表達與足細胞中，對維持足細胞的分化、增殖和結構形態具有重要作用。研究顯示，Cdk5/p35的異常表達與DN中腎功能損傷、足細胞凋亡密切相關〔2，11〕。本結果提示高濃度的葡萄糖是引起足細胞中Cdk5/p35表達增高的主要原因，而高滲透對此則沒有影響。

在非神經細胞中，Cdk5調節多種復雜生物進程的功能多樣性提示Cdk5的活性調控具有嚴格的調節機制。然而，有關Cdk5活性調控機制的知識仍然有限。公認的對Cdk5活性具有顯著調節作用的是Cdk5調節蛋白p35和p39。這兩種調節蛋白可被多種細胞因子、生長因子，神經營養因子等通過轉錄水平上調表達，并通過與Cdk5的特異性結合調控其激酶活性〔8，9〕。但在糖尿病腎組織損傷中，高糖引起Cdk5/p35表達增高的調控機制尚不清楚。

TGF-β是一種多功能的細胞因子，可以自分泌和(或)旁分泌的方式通過與細胞膜表面的受體相結合，激活相應的信號傳導通路，如Smads通路，發揮對細胞增殖、分化和凋亡的調節作用〔12，13〕。TGF-β1介導的足細胞損傷在DN蛋白尿的產生、腎小球硬化等病理過程中發揮了重要作用〔14〕。研究顯示，以TGF-β1刺激原代培養的神經元，可顯著增加神經元中Cdk5/p35的表達及Cdk5的蛋白激酶活性〔4〕。但在高糖刺激的足細胞中，Cdk5/p35表達增高是否同TGF-β信號通路相關，尚未有文獻報道。本文結果提示SB431542能有效抑制高糖刺激引起的TGF-β1信號通路活化。同時，高糖刺激引起的Cdk5/p35的表達上調被顯著抑制，其蛋白和mRNA表達水平均顯著低于HG組，顯示出明顯的濃度依賴性，以10 μmol/L SB431542處理的抑制效果最明顯。Roscovitine是Cdk5的激酶活性抑制劑，應用其處理高糖及TGF-β1培養的足細胞后，高糖及TGF-β1誘導的足細胞凋亡有顯著的降低，提示高糖刺激可通過TGF-β1信號通路的活化上調足細胞內Cdk5/p35的表達水平，從而誘導足細胞凋亡，這可能是糖尿病(DM)足細胞損傷的原因之一。

本研究結果提示TGF-β1可能是高糖刺激上調表達Cdk5/p35從而引起足細胞凋亡的原因。深入的機制研究闡明Cdk5/p35在(DM)及其并發癥，特別是DN中的作用，有助于開發出針對性的新的治療方式，以減少DM并發癥的發生，改善DM病人的生活質量。

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〔2014-09-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

〔中圖分類號〕R322.61

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1795-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.003

通訊作者：劉巍(1979-)，男，博士，副教授，碩士生導師，主要從事糖尿病腎病發病機制研究。

基金項目：河北省自然科學基金資助項目(No.p013206139)；河北省高等學校科學技術研究項目(No.Q2013002)；河北省醫學科學研究重點課題計劃(No.20130140，No.20130461)

1河北醫科大學診斷學教研室

第一作者：李宏博(1976-)，男，碩士，實驗師，主要從事糖尿病腎病發病機制研究。