白藜蘆醇下調Cyclin家族表達調節皮膚癌HS-4細胞的增殖

李　慧

(湖北民族學院附屬民大醫院皮膚科，湖北　恩施　445000)

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白藜蘆醇下調Cyclin家族表達調節皮膚癌HS-4細胞的增殖

李慧

(湖北民族學院附屬民大醫院皮膚科，湖北恩施445000)

〔摘要〕目的探討中藥白藜蘆醇(Res)對人皮膚癌HS-4細胞增殖的調節作用。方法利用MTT實驗篩選Res對人皮膚癌HS-4細胞的最適作用濃度，對細胞的增殖情況進行測定；利用流式細胞技術觀察Res對人皮膚癌HS-4細胞增殖周期產生的影響；采用Real-time PCR檢測某些周期相關因子的mRNA表達；Western印跡檢測某些周期相關蛋白改變情況。結果Res對人皮膚癌HS-4細胞毒性存在明顯的正相關關系，其中20 mg/L的Res作用72 h對人皮膚癌HS-4細胞的增殖抑制率達到最大；加入Res處理48 h 后人皮膚癌HS-4的G0/G1期細胞數目明顯比對照組多(P<0.05)，S 期細胞數目比對照組低(P<0.05)，G2/M期細胞數目兩組差別不明顯；Real-time PCR和Western印跡檢測某些周期相關因子均發生明顯改變。結論Res可抑制HS-4細胞增殖,其機制可能是其能影響皮膚癌HS-4細胞周期，將其阻滯于G1期，為Res在皮膚癌中應用提供基礎。

〔關鍵詞〕白藜蘆醇；皮膚癌；細胞周期

皮膚癌主要包括鱗狀細胞癌和基底細胞癌〔1〕，近年來發病率越來越高〔2,3〕。白藜蘆醇(Res)是一種植物抗毒素，廣泛存在于多種植物中。許多研究發現Res有多種生物活性，如抗氧化、改善微循環以及抗感染等〔4〕。Res對多種腫瘤都有一定的治療作用，例如乳腺癌、肝癌、胃癌及肺癌等〔5～8〕。本實驗旨在通過研究Res對皮膚癌HS-4細胞生長的調節作用，明確其對皮膚癌是否也具有抗腫瘤作用。

1材料與方法

1.1藥物和制劑Res(美國Sigma公司,純度>99%)，用二甲基亞砜(DMSO)溶解,0.22 μm尼龍濾膜過濾除菌,母液質量濃度為100 g/L,-20℃避光保存。HS-4細胞購自美國ATCC，胎牛血清、Trypin-EDTA 及DMEM培養液購于美國Gibco 公司，MTT、DMSO 購于國藥集團化學試劑有限公司，細胞周期檢測試劑盒(中國上海貝博生物有限公司)，一抗及二抗購自武漢三鷹公司，丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris堿、TEMED、十二烷基硫酸鈉(SDS)、過硫酸銨(APS)、吐溫-20(Tween-20)購于上海生工生物工程公司。電化學(ECL)顯影液west Femto 及ECL west Pico 顯影液購于美國Pierce 公司，TRIzol 試劑購于美國Invitrogen 公司。逆轉錄試劑盒購于美國Fermentas 公司，Real-time PCR試劑盒購于日本Takara 公司。

1.2儀器化學發光儀(美國GE Healthcare，型號LAS4000)，超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司，型號ZHJH-C1109B )，移液器(美國Eppendorf 公司)，垂直電泳儀(美國Bio-Rad 公司，型號165-3301 )，熒光定量PCR 儀(美國Stratagene 公司，型號Mx3000P)，CO2細胞培養箱(美國Thermo 公司，型號Forma 3111)。

1.3方法

1.3.1細胞培養HS-4細胞生長于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，于 5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養傳代。用含0.02% EDTA的0.25% 胰酶消化液消化細胞，并進行傳代，傳至4、5代左右，選取生長狀態良好、增殖旺盛的細胞用于研究。

1.3.2MTT法檢測人皮膚癌HS-4細胞的增殖取生長狀況良好的對數期細胞進行消化，輕柔吹勻，調整為密度為3×104～3.5×104個/ml的單細胞懸液，接種于96孔板中，每孔200 μl，每組每個時間點設置3個重復孔，培養6 h后，實驗組加入含有Res成分的培養基，并在0 h的實驗組和對照組每孔中加入20 μl的MTT。反應4 h后，棄液，加入150 μl DMSO，置于搖床上勻速搖30 min，待結晶完全溶解后，用空白調零，利用自動酶標儀測定490 nm下各孔的光吸收值，實驗組的抑制率= 1 - A實驗組/A對照組× 100%。

1.3.3流式細胞術分析細胞周期取生長狀態良好的HS-4細胞，接種于6 孔板內，每孔2×104個/ml，加入2 ml培養基。置于37℃，5% CO2的培養箱中培養過夜，換成無血清的培養基，培養12 h使細胞周期同步化。當細胞達50%融合時，加入2.00 mg/L的 Res，培養48 h后，收集培養的細胞2 000 r/min離心15 min，重懸于200 μl 4℃預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，緩慢輕柔的加入600 μl 75%的預冷的乙醇，對細胞進行懸浮固定，4℃過夜。離心棄乙醇，500 μl PBS重懸細胞，加入RNaseA至終濃度100 μg/ml，37℃水浴30 min，碘化丙啶(PI，20 μg /ml)染色30 min，上機檢測，利用Mod Fit LT軟件分析細胞周期。

1.3.4Real-time PCR檢測某些周期相關因子的表達檢測加入Res后HS-4細胞中P21、PCNA、Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D mRNA 的相對表達量。抽提RNA，并將其逆轉錄合成cDNA。反應條件:42℃ 60 min，70℃ 10 min。以反轉錄反應產物cDNA 為模板，使用Real-time PCR檢測P21、PCNA、Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D mRNA 的相對表達量，每個樣品設置3個復孔。內參照為GAPDH。實時PCR反應條件:95℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 30 s，共39個循環。溶解曲線條件:95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃15 s。根據反應結束后的Ct 值(每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所對應的循環數)，通過2-△△Ct法計算樣品中多種mRNA 的相對表達量〔3〕，所得產物經1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.3.5Western印跡分析將對照組和Res組培養至對數生長期，細胞按2×104個/孔的數量加入6孔板中，培養72 h后，用PBS洗滌3次，用細胞刮收集細胞，12 000 r /min離心30 min，收集上清。抽提總蛋白，測定蛋白濃度，然后加入5×loading，95℃浴煮10 min。40 μg蛋白進行凝膠電泳，用濕式轉膜儀將凝膠中的蛋白轉移到PVDF膜上，5%的脫脂牛奶封閉60 min，將PVDF膜用TBST洗滌2次，10 min/次。分別加入相應抗體，內參用鼠抗人GAPDH，4℃孵育過夜后棄去一抗，用TBST洗滌3次×15 min。再分別加入辣根酶標記的二抗，室溫孵育1 h后棄抗體，然后用TBST 洗滌3次，每次15 min?；瘜W發光儀使用ECL 顯影液進行顯影。以GAPDH作為內參。

1.4統計學方法采用SPSS18.0軟件行t檢驗。

2結果

2.1Res對HS-4細胞增殖的抑制作用Res可明顯抑制HS-4細胞的增殖，藥物濃度為20 mg/L、時間為72 h對細胞增殖影響變化最明顯 (見圖1)。

圖1　Res對HS-4細胞增殖的影響

2.2Res對細胞周期的影響20 mg/L的Res作用48 h后可對人皮膚癌HS-4細胞的細胞周期產生明顯的阻滯作用，影響了HS-4細胞周期各時相的分布，G0/G1期細胞比例(89.0%±4.41%)顯著高于助溶劑DMSO對照組(80.8%±2.84%)(P<0.01)，S 期細胞比例(6.14%±0.63%)顯著低于對照組(13.34%±1.22%)(P<0.01)，G2/M期細胞比例(4.86%±1.69%，5.87%±2.41%)無顯著性差異。

2.3Western印跡檢測細胞周期相關蛋白表達采用兔抗P21、PCNA、Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D單克隆抗體，選取GAPDH為內參，運用Western印跡檢測20.00 mg/L Res處理細胞72 h后抽提的蛋白與對照組中相應蛋白的表達情況，P21 表達上調，PCNA 表達下調，Cyclin 家族Cyclin A、Cyclin B及Cyclin D均表達下調，見圖2。

圖2　Western印跡檢測周期相關因子

2.4Real-time PCR檢測某些周期相關因子的表達20 mg/L的Res作用48 h后，周期相關因子P21、PCNA、Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D mRNA 的相對表達量均發生明顯改變(分別為2.8、0.51、0.24、0.37、0.32，對照組設為1)，細胞周期阻滯在G1期。

3討論

Res化學名稱為 3，4'，5-三羥基芪，1940年第一次從毛葉葉黎蘆(veratrum grandiortua O.Loes)的根部分離獲得〔9〕。眾所周知，生長信號的異常活化將進一步導致細胞增殖異常的發生〔10〕。隨著進一步研究發現，腫瘤共性在于其無限性生長，而眾學者認為這種無限增殖行為的產生可能是細胞周期紊亂導致〔11〕。因此，我們可以認為腫瘤是一種細胞無限性生長導致的細胞疾病〔12〕。大量研究顯示，Res 可以預防和緩解癌癥、心血管疾病等多種疾病〔13〕。Res 對多種癌癥都有不同程度的拮抗作用，如胃腸道癌、生殖器官癌、結直腸癌等〔14～16〕。因此，Res被認為是目前最有望進入臨床的天然抗癌藥之一。

本研究結果推測20.00 mg/L的Res可能是其最大值，濃度越高，彼此之間有重疊，反而削弱了其增殖抑制作用。流式結果顯示，經Res處理后細胞周期阻滯在G1期，細胞增殖速度慢，DNA合成量減少，從而大大降低腫瘤細胞數目。Real-time PCR 和Western印跡對細胞周期相關因子的檢測結果也表明Res處理后細胞阻滯在G1期，P21表達水平上調明顯，PCNA、Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D表達水平均下調明顯，出現明顯的抑制增殖趨勢。

綜上所述，20.00 mg/L Res處理人皮膚癌HS-4細胞能夠顯著抑制HS-4細胞的惡性增殖，減少腫瘤數目，從而為皮膚癌的診治提供新的思路，有望成為皮膚癌治療的新方法，值得在臨床推廣。

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〔2015-07-26修回〕

(編輯李相軍)

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1802-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.005

第一作者：李慧(1978-)，女，碩士，主治醫師，主要從事皮膚性病研究。