滋補脾陰法對糖尿病腦病大鼠皮質線粒體膜電位和活性氧的影響

孫　錚　戰麗彬　姜如嬌　隋　華　梁麗娜　李　照

(大連醫科大學中西醫結合基礎研究所，遼寧　大連　116044)

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滋補脾陰法對糖尿病腦病大鼠皮質線粒體膜電位和活性氧的影響

孫錚戰麗彬1，2姜如嬌隋華梁麗娜李照

(大連醫科大學中西醫結合基礎研究所，遼寧大連116044)

〔摘要〕目的研究滋補脾陰法改善大鼠糖尿病腦病及其線粒體相關機制。方法SD大鼠分為對照組，糖尿病腦病組(DM組)，滋補脾陰組(ZBPYR組)，健脾益氣組(BZYQ組)和滋補腎陰組(LWDH組)。水迷宮評價學習記憶能力，JC-1和DCFH標記法檢測線粒體膜電位(△Ψm)高低、活性氧(ROS)含量。結果ZBPYR組水迷宮潛伏期低于DM組(P<0.01)，BZYQ和LWDH組與DM組無統計學差異ZBPYR組△Ψm高于DM組(P<0.05)，BZYQ和LWDH組△Ψm較DM組無統計學意義;DM組ROS高于ZBPYR組(P<0.05)，與BZYQ和LWDH組相比無統計學意義。結論ZBPYR提高△Ψm，降低ROS改善糖尿病腦病大鼠皮質線粒體功能，提高認知能力。

〔關鍵詞〕滋補脾陰法;糖尿病腦病;線粒體膜電位;活性氧

隨著對糖尿病(DM)研究的深入，人們發現DM認知功能障礙(DACD)也是DM中樞神經系統并發癥之一，特別是與2型糖尿病(T2DM)和阿爾茨海默病(AD)關系尤為密切〔1〕。它可導致中樞神經系統損傷而影響大腦認知功能，表現為輕、中度認知功能障礙，學習和記憶能力下降，甚至發生AD〔2〕。胰島素抵抗是導致DACD的主要因素〔3，4〕，并且胰島素抵抗與線粒體功能紊亂、ATP產生下降密切相關〔5〕。線粒體是機體產生活性氧(ROS)的重要部位，當線粒體跨膜電位(△Ψm)下降時，線粒體氧化磷酸化效率降低，大量的超氧自由基產生。因此通過調節△Ψm、降低ROS的水平而改善線粒體功能是治療DACD的合理途徑。中醫學認為，DACD屬消渴合并癡呆，對于本病的治療，有從腎虛辨證者，認為腎精虧虛是本病的發病之本，臨床上多用六味地黃丸治療;有從痰、瘀論治者，認為痰、瘀閉竅是本病的發病關鍵，多用半夏白術天麻湯、血府逐瘀湯治療〔6〕。臨床實踐發現DACD與中醫脾陰虛證關系密切，因此本研究選擇滋補脾陰方藥治療DACD。滋補脾陰方藥(ZBPYR)是由清代吳澄《不居集》中資成湯加味而成。本研究旨在探討滋補脾陰法改善DACD大鼠線粒體功能紊亂的具體作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物SPF級健康成年雄性SD大鼠25只，體重(200±20)g，由大連醫科大學動物中心提供〔許可證號：SCXK(遼)2008-0002〕。SPF級環境飼養，溫度(22±3)℃，濕度50%，自由飲水，明暗交替12 h。

1.2藥物與試劑ZBPYR(紅參30 g，山藥15 g，茯神15 g、白芍15 g、丹參12 g、扁豆15 g、蓮肉20 g、石菖蒲10 g、遠志10 g、檀香4.5 g、橘紅9 g、甘草9 g)、補中益氣湯(BZYQ，黃芪18 g、人參9 g、白術9 g、炙甘草6 g、升麻3 g、柴胡3 g、當歸9 g、陳皮6 g)和六味地黃湯(LWDH，熟地24 g、山萸肉12 g、山藥12 g、茯苓9 g、澤瀉9 g、丹皮9 g)均一次性購自大連美羅醫藥公司。鏈脲佐菌素(STZ)、檸檬酸及檸檬酸鈉均購于Sigma公司。蛋白酶抑制劑購自Thermo公司。線粒體提取試劑盒購自Abcam公司。BCA蛋白定量試劑盒購自康為世紀公司。線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)購自碧云天生物技術研究所。線粒體ROS檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。普通飼料：按照中華人民共和國《實驗動物大鼠小鼠配合飼料》(GB14924.3-2001)進行配制生產，購自南京安立默科技有限公司。高脂飼料：按照Shi等〔7〕的配方。購自南京安立默科技有限公司。

1.3儀器冷凍切片機(Leica公司)臺式高速離心機(Thermo公司);多功能酶標儀(Molecular Devices公司)，Morris水迷宮(NOLDUS公司)。

1.4方法

1.4.1動物造模并分組SD大鼠隨機分成空白對照組、糖尿病腦病組(DM，高脂飼料喂養+STZ)，滋補脾陰治療組(ZBPYR，高脂飼料喂養+STZ+滋補脾陰方藥)、健脾益氣治療組(BZYQ，高脂飼料喂養+STZ+補中益氣湯)、滋補腎陰治療組(LWDH，高脂飼料喂養+STZ+六味地黃湯)，每組5只。采用高脂飼料聯合小劑量STZ注射建立T2DM模型。適應性喂養3 d后，空白對照組全程以普通飼料喂養，DM組、ZBPYR組、BZYQ組和LWDH組改為高脂飼料喂養。高脂飼料喂養6 w后，DM組、ZBPYR組、BZYQ組和LWDH注射STZ造模：注射前1 d禁食12 h，按30 mg/kg的劑量一次性腹腔注射1%STZ溶液(0.1 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液配制，pH 4.2～4.5，現用現配，30 min內注射完)。空白對照組注射等體積量檸檬酸緩沖液。72 h后尾靜脈采血測量隨機血糖，隨機血糖>16.7 mmol/L的大鼠初步確定為T2DM模型造模成功。以后每2周監測1次隨機血糖，隨時剔除血糖低于16.7 mmol/L的大鼠。第18周給予藥物干預。中藥以常規水煎，去渣取汁，合并兩次藥液，水浴濃縮至所需生藥濃度(按生藥計算)，4℃保存，用于定時加熱灌胃。灌胃劑量10 ml/kg體重。空白對照組給予生理鹽水灌胃，生藥濃度為9.12 g/ml，BZYQ生藥濃度為4.2 g/ml，LWDH湯生藥濃度為5.0 g/ml。各組大鼠在藥物干預第6周進行水迷宮實驗。

1.4.2學習記憶測試通過Morris水迷宮實驗進行工作記憶能力的測試。測試包括:①定位航行實驗。歷時5 d,第1天為適應性訓練，將池中平臺撤去，使大鼠在池中自由游泳120 s，以后4 d每天訓練4次，每次訓練間隔60 s。訓練時隨機選擇一個入水點入水(4次分別從4個象限入水)，將大鼠面向池壁放入水中，迫使大鼠學習尋找設于水面以下的平臺。記錄120 s內尋找平臺所需時間(潛伏期)。如果大鼠入水120 s內未能找到平臺，則將其引導至平臺，并在平臺停留60 s，潛伏期記錄為120 s。②空間探索實驗，定位航行實驗結束后撤除平臺，任選1個入水點將大鼠面向池壁放入水中,記錄120 s內跨越原平臺位置的次數。

1.4.3腦組織制備所有手術器械均用75%酒精浸泡后使用，大鼠經4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，冰臺上斷頭，剝去頭皮，用剪刀于顱骨上剪一小口，用血管鉗撬去顱骨充分暴露腦組織，快速取出皮質，放于1.5 ml的凍存管中，速置液氮中，然后放置于-80℃冰箱保存備用。

1.4.4線粒體提取皮質置于低溫冷凍切片機中按照(5 μm/片)組織切片，參考試劑盒說明提取。BCA法測定線粒體懸液的蛋白濃度。

1.4.5△Ψm檢測90 μl 5倍稀釋的JC-1染色工作液中加入10 μl蛋白濃度0.5 μg/μl純化的線粒體并混勻。檢測JC-1單體(綠色熒光)采用490 nm波長激發，測定530 nm的發射光強度。檢測JC-1聚合物(紅色熒光)采用525 nm波長激發，測定590 nm的發射光強度。計算紅綠熒光的相對比值衡量線粒體膜電位的高低。

1.4.6線粒體ROS檢測190 μl蛋白濃度0.5 μg/μl純化的線粒體加入10 μl的1 mmol/L DCFH-DA工作液充分混勻，37℃孵育30 min，485 nm波長激發，測定525 nm的發射光強度。

1.5統計學方法采用SPSS17.0統計學分析軟件，組間比較行單因素方差分析。

2結果

2.1各組大鼠學習記憶能力比較定位航行實驗結果表明在第2～5天的實驗中，DM組Morris水迷宮潛伏期均長于空白對照組(P<0.01，P<0.05)。ZBPYR組的潛伏期第2、3天時少于空白對照組(P<0.05)，第4、5天相比空白對照組無統計學差異。BZYQ組和LWDH組在整個水迷宮實驗中潛伏期長于空白對照組(P<0.05)。LWDH組在第2天和第3天實驗中潛伏期長于空白對照組(P<0.05)。ZBPYR組的潛伏期少于DM組(P<0.01)。BZYQ和LWDH組較DM組相比潛伏期無統計學差異。空間探索實驗結果表明DM組120 s內跨越原平臺次數少于空白對照組(P<0.05)。ZBPYR組穿越平臺次數多于DM組(P<0.05)，BZYQ和LWDH組較DM組相比穿越原平臺次數無統計學差異。見表1。

2.2中藥治療對DM腦病大鼠皮質△Ψm的影響空白對照組皮質△Ψm高于其他各組(P<0.05);ZBPYR組皮質△Ψm高于DM組(P<0.05)；BZYQ組和LWDH組△Ψm較DM組相比無統計學差異。見表1。

2.3中藥治療對DM腦病大鼠皮質線粒體ROS的影響空白對照組的ROS含量高于其他各組(P<0.05)，DM組的ROS含量高于ZBPYR組(P<0.05)，但與BZYQ組和LWDH組相比無統計學差異。見表1。

表1各組大鼠Morris水迷宮測試及△Ψm、ROS比較(x±s,n=5)

組別潛伏期(s)第2天第3天第4天第5天穿越次數△ΨmROS(%)空白對照組20.27±2.7613.25±4.6012.83±3.7714.91±3.194.59±0.872.35±0.06100±2.5DM組58.15±3.091)54.32±3.502)53.01±2.992)45.24±3.522)1.93±0.941)1.57±0.111)276.57±6.052)ZBPYR組30.70±2.292)4)33.28±4.192)4)17.49±4.154)16.37±3.064)3.63±1.023)1.85±0.061)3)152.37±6.102)3)BZYQ組57.56±3.042)60.99±3.502)53.56±4.002)53.98±4.082)1.51±0.802)1.65±0.191)273.17±1.262)LWDH組56.43±2.862)43.77±4.862)35.85±3.242)34.38±3.722)2.12±0.661)1.65±0.091)271.63±2.472)

與空白對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01;與DM組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

3討論

中醫認為，脾主運化，是津液生化輸布之樞機，脾病可直接導致津液、精微物質代謝功能紊亂而發生消渴病變即DM。脾主運化，為氣血生化之源，氣血充足方能充養腦髓，故脾虧虛則氣血化生不足，腦髓失養而易發生老年癡呆。又因脾為太陰，乃三陰之長，故治陰虛者，當以滋脾陰為主。

ΔΨm是由于線粒體內膜與外膜的通透性之間的差異引起的電化學質子梯度勢能差，由線粒體內膜呼吸鏈活動形成，是衡量線粒體功能的敏感指標。在外周組織中的實驗研究證實，DM可導致線粒體呼吸作用受損，△Ψm下降〔8,9〕。ROS是當機體能量代謝平衡遭到破壞時，由細胞線粒體在氧代謝過程中大量產生，它可引發氧化應激反應。ROS是反應活性極強的代謝衍生分子,包括O2-、H2O2和HO等〔10〕，其過量產生可破壞細胞系統中的氧化與抗氧化的動態平衡，導致線粒體功能損傷。有研究證實ROS水平與胰島素抵抗密切相關，應用藥物或營養素可通過降低ROS的水平而改善胰島素抵抗〔11,12〕。在本研究中，我們觀察到DM組大鼠存在學習記憶障礙，皮質線粒體中△Ψm明顯降低，ROS含量增加，而這些可能與DACD的發生存在一定的聯系。

前期研究發現ZBPYR能明顯改善衰老大鼠的學習記憶能力，其腦內機制可能在于增強腦線粒體膜的抗氧化能力，維持磷脂水平，提高線粒體呼吸酶活性相關〔13〕。DACD與腦衰老有許多相似之處。本研究結果說明ZBPYR可改善DM大鼠皮質線粒體功能，從而調節細胞的能量代謝水平，達到提高認知功能的目的。本文結果提示以效測證，DM腦病大鼠以表現脾氣陰兩虛證為主，并為伴有學習記憶下降的DM患者的臨床治療提供新方法。

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〔2014-12-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

Intervention effect of Zibupiyin method on mitochondrial membrane potential and ROS level in the prefrontal cortex of diabetic encephalopathy rats

SUN Zheng,ZHAN Li-Bin,JIANG Ru-Jiao,et al.

College of Integrative Medicine and Institute of Integrative Medicine,Dalian Medical University,Dalian 116044,Liaoning,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the protection of Zibupiyin Recipe(ZBPYR) on the prefrontal cortex of deficiency diabetic encephalopathy rats and its mitochondrial mechanism.MethodsSD rats were randomly divided into five groups(n=5 each group):the control(Con),the diabetes(DM),the Zibupiyin(ZBPYR),the Jianpiyiqi(BZYQ)and Zibushenyin(LWDH)groups.Spatial learning and memory performance were assessed using the Morris water maze.JC-1 and DCFH labeling were used to test the mitochondria membrane potential(ΔΨm)and ROS level in prefrontal cortex of SD rats.ResultsThe latency of the ZBPYR group was significantly shorter compared with that of the DM group(P<0.01).The ΔΨm levels of ZBPYR group was increased than that of DM group(P<0.05),while the ROS level of ZBPYR group was decreased(P<0.05).There were no significant differences in the latency,level of ΔΨm and ROS between BZYQ and LWDH groups.ConclusionsZBPYR plays a vital role in the protection of DM in rat cerebral cortex and the mechanism of it may be associated with improvement of mitochondrial membrane potential and inhibition of ROS.

【Key words】Zibupiyin recipe;Diabetic encephalopathy;Nitochondrial membrane potential;ROS

〔中圖分類號〕R285.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1804-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.006

通訊作者：戰麗彬(1964-)，女，教授，博士生導師，主要從事中西醫結合防治老年腦病的基礎與臨床研究。

基金項目：國家自然科學基金重點項目(81230084)；高等學校博士專項科研基金(20112105110006)；中國博士后科學基金(2013M541232)

1大連醫科大學附屬第二醫院2南京中醫藥大學基礎醫學院

第一作者：孫錚(1983-)，女，博士，講師，主要從事中西醫結合防治老年腦病的基礎與臨床研究。