肝素對溺水小鼠腦損傷的保護作用

杜　斌　阿米娜　陳俊良　陳　煒　龐慶豐

(江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院,江蘇　無錫　214122)

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肝素對溺水小鼠腦損傷的保護作用

杜斌阿米娜陳俊良陳煒1龐慶豐

(江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院,江蘇無錫214122)

〔摘要〕目的觀察肝素對溺水小鼠腦損傷的保護作用。方法選用雄性ICR小鼠，隨機分為正常組，模型組，肝素組。小鼠溺死模型建立成功后，將小鼠斷頭處死，取全腦。作病理切片，觀察各組腦組織切片HE染色組織形態(tài)學(xué)改變。測定腦組織中脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)活力，檢測超氧化物歧化酶(SOD)活性。結(jié)果與模型組相比，肝素組腦組織HE染色顯示神經(jīng)元清晰有所改善。與正常組比較，模型組腦組織 MPO活力、MDA含量增高，SOD活性低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，肝素組腦組織中的MPO活力、MDA含量降低，SOD活性增高(P<0.01)。結(jié)論肝素對溺水引起腦氧化損傷有明顯的保護作用，可能與其抗氧化損傷有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕肝素；溺水；腦損傷

肝素是臨床常用的抗凝藥物〔1〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)，肝素除具有抗凝活性外，具有潛在的抗炎活性〔2〕。本實驗擬觀察肝素對溺死模型小鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)及炎癥等指標(biāo)的影響，探討肝素對溺死模型腦組織的保護作用及機制。

1材料與方法

1.1實驗動物ICR 小鼠45 只，SPF 級，體質(zhì)量(20±2)g，上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供(合格證編號2007000564424)，許可證號：SCXK(滬)2012-0002。

1.2儀器與試劑RM2135石蠟切片機(德國徠卡微系統(tǒng)有限公司)；80i正置熒光顯微鏡(日本尼康公司)；U410超低溫冰箱(德國艾本德有限公司)；TG16A-WS臺式離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；TS-8型漩渦混勻器(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)；DK-8B型電熱恒溫水浴槽(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；ME204E電子天平〔梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司〕；ELX800全自動酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)；5804R多功能臺式離心機(德國艾本德有限公司)。丙二醛(MDA)(批號20141202)、超氧化物歧化酶(SOD)(20141201)試劑盒，髓過氧化物酶(MPO)(批號20141128)、 考馬斯亮藍(批號20150109)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，肝素注射液(批號1406112)，其他試劑為國產(chǎn)分析純。水源為太湖水，常溫。

1.3實驗方法參考馬艷艷等〔3〕方法，并加以改進，建立小鼠溺亡模型。將實驗小鼠隨機分為正常組、溺亡組、肝素組，每組15只。實驗前1 d小鼠禁食，自由飲水。肝素組在溺亡前30 min腹腔注射肝素〔4〕。將小鼠放入1個內(nèi)壁光滑的50 ml離心管內(nèi)(要求離心管兩端有孔，將小鼠放置于管內(nèi)并充滿水，此步驟在充滿水的桶內(nèi)操作，水面高度與離心管上緣距離為10 cm)，讓其自由游泳并仔細觀察，其第1次嗆水時按秒表計時，直至小鼠溺死。溺死后將小鼠完全從水中取出，建立小鼠溺亡模型。小鼠溺死指征：口唇黏膜蒼白明顯，軀干強直，四肢無游泳動作，頭部幾乎不能浮出水面，隨后身體逐漸下沉至容器底部，抓取時無任何反抗動作。溺亡9 min后，取下小鼠腦組織。正常組小鼠直接取下腦組織。

1.4病理學(xué)檢測將小鼠腦組織置于10%中性甲醛固定液中固定24 h,石蠟包埋，4 μm切片，HE染色，鏡下觀察。

1.5腦組織氧化指標(biāo)測定取腦組織勻漿(腦組織∶生理鹽 水=1∶10)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測MDA、SOD、MPO含量及活性。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用 SPSS11.5軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1腦組織形態(tài)學(xué)變化正常組腦組織結(jié)構(gòu)完整、 神經(jīng)元清晰；模型組腦水腫范圍累及灰質(zhì)和白質(zhì)，神經(jīng)元缺失或退變。血管擴張充血；肝素組神經(jīng)元清晰有所改善、數(shù)目較模型組增加，見圖1。

2.2肝素對溺死小鼠腦組織SOD活性、MDA 含量、MPO活力的影響與正常組比較，模型組腦組織 MPO活力、MDA含量增高，SOD活性降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，肝素組腦組織中的MPO活性、MDA含量降低，SOD活性增高(P<0.01)。見表1。

圖1　各組小鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化(HE,×400)

組別SOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)MPO(U/g)正常組180.4±11.19.1±0.40.22±0.03模型組154.6±9.31)13.8±0.62)0.65±0.082)肝素組166.1±5.31)2)12.1±0.52)0.46±0.092)

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

3討論

溺水會導(dǎo)致急性呼吸系統(tǒng)損傷、電解質(zhì)紊亂、腎衰竭、腦水腫、心力衰竭、溶血等損傷，最后甚至?xí)?dǎo)致多臟器功能不全綜合征(MODS)〔5〕。有研究表明，肝素可以通過抑制免疫刺激或非免疫刺激誘導(dǎo)的肥大細胞活化、抑制白細胞黏附于血管內(nèi)皮細胞、抑制細胞凋亡途徑發(fā)揮其抗炎作用〔6～9〕。MDA含量間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，因此，MDA被認為是反映機體氧化損傷最具代表性的指標(biāo)之一。SOD是最先與活性氧自由基作用的酶，是機體抗氧化防御的第一道防線〔9,10〕。MPO通過產(chǎn)生自由基和多種具有氧化活性的物質(zhì)，促進斑塊形成和增加其不穩(wěn)定性〔11〕。本實驗結(jié)果表明，肝素具有不同程度的抗氧化應(yīng)激作用。從腦組織形態(tài)學(xué)觀察，肝素組小鼠在溺亡后腦組織損傷有所減輕，說明肝素的抗凝、抗炎作用對腦組織作用明顯。腦代謝旺盛，是極易受損傷的組織，肝素對其損傷有一定的保護作用，其作用機制尚有待于深入的研究。

4參考文獻

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〔2015-12-13修回〕

(編輯李相軍)

Effects of Heparin on brain injury of mice of water drowning

DU Bin,A Mi-Na,CHEN Jun-Liang,et al.

Wuxi Medicine School of Jiangnan University,Wuxi 214122,Jiangsu,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effect of Heparin on brain injury in mice challenged water drowning.MethodsICR male mice were randomly divided into normal,model,Heparin groups.After 9 min,the level of superoxide dismutase(SOD),malondialdehyde(MDA)and myeloperoxidase(MPO)were measured,the pathologic changes of the brain tissue sections were observed under microscope with HE staining.ResultsCompared with model group,clear improvement and the increasing number of nerve cell in Heparin group.Compared with normal group,the level of MDA and MPO in the brain tissue were increased,the level of SOD in the brain tissue was decreased in model group(P<0.05，P<0.01).Compared with model group,the level of MDA and MPO in the brain tissue were decreased,the level of SOD in the brain tissue was increased in Heparin group (P<0.01).ConclusionsHeparin has protective effect on brain oxidative damage induced by water drowning,which might be related to its antioxidation ability.

【Key words】Heparin;Drowning;Brain injury

〔中圖分類號〕R965.1

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1811-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.009

通訊作者：龐慶豐(1972-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事臟器保護研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81270126)

1無錫市第三人民醫(yī)院急救中心

第一作者：杜斌(1983-)，男，實驗師，主要從事藥理學(xué)及解剖學(xué)實驗研究。