清心安神方對豚鼠心室肌細胞動作電位的影響

方居正　虞雅倩　高　穎　夏艷斐

(平頂山市中醫醫院內三科，河南　平頂山　467000)

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清心安神方對豚鼠心室肌細胞動作電位的影響

方居正虞雅倩1高穎1夏艷斐

(平頂山市中醫醫院內三科，河南平頂山467000)

〔摘要〕目的探討清心安神方對豚鼠心室肌細胞動作電位的影響。方法60只健康雄性豚鼠隨機分為含藥血清組24只，空白血清組36只。含藥血清組使用清心安神方濃縮液連續灌胃3 d，空白血清組給予等量生理鹽水進行灌胃，兩組豚鼠均在末次用藥1 h后，于腹主動脈取血后離心取血清。分離豚鼠心室肌細胞，用膜片鉗技術記錄膜電位曲線。結果含藥血清組豚鼠單個心室肌細胞動作電位復極至50%(APD50)及APD90延長(P<0.05),而動作電位幅值(APA)、APD50～90及3相復極速率(V3)差異無統計學意義(P>0.05)；血清對照與血清洗脫、血清洗脫與含藥血清組比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論清心安神方可延長豚鼠心室肌細胞全細胞動作電位APD50及APD90。

〔關鍵詞〕清心安神方；全細胞動作電位；動作電位時程

研究報道〔1〕，傳統治療心律失常藥物的有效率為30%～60%，但幾乎都伴有致心律失常的副作用，導致惡性心律失常和死亡率明顯升高。清心安神方以清心除煩為治則，佐以重鎮安神之品，對治療主動性心律失常臨床效果良好，但其作用機制尚未明確。本研究采用血清藥理學的方法擬分析清心安神方含藥血清對豚鼠心室肌細胞動作電位及內向整流鉀電流的影響。

1材料與方法

1.1動物選取河南中醫學院中心試驗室喂養1 w，總重量250～350 g的健康成年豚鼠，常規喂養，觀察其進食水、大小便及精神情況，從中選取健康雄性豚鼠60只，并隨機分為含藥血清組24只，空白血清組36只。

1.2血清制備含藥血清組使用清心安神方制成的藥液進行灌胃(劑量為豚鼠表面體積等效劑量的5倍進行換算后，以特定方法濃縮至2.25 g生藥/ml)，空白血清組2次/d以相等表面體積生理鹽水灌胃，連續進行3 d，末次灌胃1 h后取腹主動脈血，并將血液在室溫下靜置1 h，3 000 r/min離心20 min，分離上層血清，水浴滅活30 min后，存放于-20℃冰箱中備用。

1.3豚鼠心室肌細胞的分離操作在20℃～25℃的室溫下，連接灌流裝置，進行水浴恒溫預熱。無鈣和含酶低鈣臺式液及細胞保存液均以95%O2+5%CO2持續低流量飽和30 min。灌流裝置用75%酒精沖洗5 min，然后用去離子水沖灌。待恒溫水浴至水浴預設值后，調節恒流蠕動泵使灌流系統出口流速為8 ml/min，然后上調水溫(至39.5℃～41℃)使出口液體溫度維持在37℃。關閉灌流系統，使用無鈣臺式液沖灌，待液柱至30 cmH2O時關閉系統。于豚鼠腹腔注射普通肝素1 000 U，10 min后以2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，無角膜反射后開胸暴露心臟，游離主動脈，在主動脈遠心端頭臂干下端摘下心臟，放入4℃無鈣臺式液中，打開恒流蠕動泵和灌流系統出口，把離體心臟放置在灌流系統出口上進行心臟灌流。然后使心臟停搏，用25 ml酶液單向灌流，然后再用溶解酶循環灌流心臟。待流出液拉絲明顯后關閉水柱夾。在心臟底部依次取少量心室肌組織放入含有少量KB液的五個培養皿中，依次分離心室肌組織并獲取單個心室肌細胞。復鈣靜置后選擇外形比較完整、透光良好、橫紋清晰無顆粒的細胞供實驗使用。

1.4鉗制模式在V-CLAMP下形成全細胞記錄模式，分別選擇I=0和I-CLAMP NORMAL模式，進行觀察并描記靜息電位值等指標。

1.5給藥方法恒流蠕動泵灌流速度2 ml/min，臺式液持續灌流5 min，記錄膜電位曲線，空白血清持續灌流5 min，記錄膜電位曲線，然后含藥血清灌流5 min，記錄膜電位曲線；最后用空白血清洗脫5 min，記錄膜電位曲線。空白血清和含藥血清重復交替灌流。

1.6刺激方案用1～5 nA的強度誘發動作電位，并以0.625 Hz的刺激頻率刺激5 ms，實驗過程中同一細胞的刺激方案應保持一致(除不能誘發AP需增強刺激強度的)。采用美國Axon公司pClampex10.1軟件控制刺激信號及輸入信號的采集。

1.7觀察指標復極50%的動作電位時程(APD50)、APD90、動作電位幅值(APA)，APD50～90及3相復極速率(V3)。

1.8統計學方法應用SPSS19.0統計軟件，組間比較進行t檢驗。

2結果

含藥血清組豚鼠單個心室肌細胞APD50及APD90延長(P<0.05),APA、APD50～90及V3的變化不明顯(P>0.05)；血清對照與血清洗脫、血清洗脫與含藥血清組比較差異無統計學意義。見表1。

表1各組指標比較(n=6，x±s)

指標血清對照組含藥血清組血清洗脫組APA(mV)139.2167±9.46814141.4000±19.09230137.4667±13.96233APD50(ms)446.8000±117.400311)648.4333±246.28332507.4000±140.481731)APD90(ms)483.1167±120.684671)692.0167±258.75045544.8167±144.190881)APD50～90(ms)36.3167±6.6351843.5833±17.1635037.4167±5.41273V3(V/s)-1.5533±0.276021.3900±0.316291.4850±0.18031

與含藥血清組比較：1)P<0.05

3討論

心律失常以其發病機制復雜、種類多樣、表現各異、藥物治療效果欠佳為特點。目前的抗心律失常藥物由于治療效果的不確定及致心律失常作用，使其臨床應用受到一定的限制。盡管目前電生理及射頻消融術治療心律失常迅速發展，但仍有一大部分治療效果欠佳。相關研究顯示〔2〕，結合中藥化學成分的藥理作用選藥組方，化學成分復雜，可起到多靶點治療作用。因此，可為心律失常的治療提供新思路。清心安神方的主要成分有苦參、黃連、甘松、丹參等，其中苦參中的苦參堿能夠增加左心室流出道慢反應自律細胞Na+通道的開放及Na+內流，抑制K+外流，起到抗心律失常的作用〔3〕；黃連中的黃連素可以延長心肌細胞的動作電位時程和有效不應期，影響折返環所需的時程，從而干預折返性心律失常的發生，另外其還可抑制血管平滑肌α受體，擴張冠狀動脈，改善心肌缺血所致的室性心律失?！?～7〕；胡朗吉等〔8〕報道甘松的主要成分可瞬間抑制動物心肌細胞外向鉀通道；而梁玲等〔9〕通過實驗證實丹參中的丹參酮ⅡA能有效縮短長QT綜合征(LQT2)模型的各層心肌細胞動作電位,并且平衡各層心肌細胞動作電位復極的差異性。

本實驗提示清心安神方可有效延長豚鼠心室肌細胞APD50及APD90，該方可通過延長 APD，從而改變心動周期時程，從而使不應期延長，心肌細胞間興奮性傳導減慢，從而減慢心率，降低竇房結和(或)異位起搏點的自律性，可在一定程度上改善和(或)降低心律失常的發生率。從動作電位形成機制分析，可能是由于激動心肌細胞L-型鈣通道(ICa-L)電流或阻斷K+通道(如IK1)電流所致。然而實驗研究顯示，清心安神方對豚鼠心室肌細胞APA、APD50～90及V3未產生顯著影響，可能是對Na+通道及復極末期外向電流IK1或IK無作用或抑制作用較弱，從而不產生明顯變化，但確切電生理機制尚不明確，還有待進一步深入研究。

4參考文獻

1蘇波.老年心臟介入治療誘發迷走神經反射和嚴重心律失常的危險因素〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(8):2053-5.

2劉建群,王雪梅,劉一文，等.基于影響藥物代謝的中藥配伍研究進展〔J〕.中國實驗方劑學雜志,2014;20(19):221-4.

3劉艷明,王雪芳.氧化苦參堿對缺血缺氧致兔心律失常保護作用及機制研究〔J〕.河北醫藥,2015;37(9):1308-10.

4王洪建,王維新,張翠蓮,等.黃連素的藥理作用和臨床應用進展〔J〕.社區醫學雜志,2006;4(7):36-8.

5王玨玥,常紅霞,費峰.鹽酸黃蓮素治療心律失常56例臨床觀察〔J〕.黑龍江醫學,1999;2(1):74.

6黃偉民,吳子達,徐有秋.黃蓮素治療心律失常的基礎電生理學研究〔J〕.心電學雜志,1985;4(1):2.

7蘇欣.黃連素治療室性早搏的療效觀察〔J〕.中國保健營養(下旬刊),2013;23(6):3287.

8胡朗吉,葛郁芝,羅駿,等.甘松揮發油對大鼠心室肌細胞瞬時外向鉀電流的影響〔J〕.時珍國醫國藥,2009;20(8):1843-5.

9梁玲,謝強,李衛華,等.丹參酮ⅡA對雌性家兔LQT2模型心肌細胞動作電位的影響〔J〕.四川大學學報(醫學版)，2013;44(5):744-6.

〔2015-06-25修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

〔中圖分類號〕R54

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1815-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.011

基金項目：河南省2013年重點科技發展計劃項目(No.132102310403)

1河南中醫學院研究生學院

第一作者：方居正(1966-)，男，博士后，主任醫師，主要從事中醫內科心血管方面的研究。