肝癌大鼠體內(nèi)TH17/Treg失衡及意義

黃剛哲　姜　華

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科，吉林　延吉　133000)

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肝癌大鼠體內(nèi)TH17/Treg失衡及意義

黃剛哲姜華1

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科，吉林延吉133000)

〔摘要〕目的觀察肝癌大鼠體內(nèi)TH17/Treg失衡狀態(tài)，從而探討免疫細胞在肝癌疾病的發(fā)病機制。方法觀察大鼠肝癌模型和對照組，提取脾臟單個核細胞，流式細胞術(shù)檢測CD3、CD4、CD8，TH17及Treg比例，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血液上清白細胞介素(IL)-17及腫瘤壞死因子(TNF)-β含量變化，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測RORγT及Foxp3含量。結(jié)果與對照組相比，肝癌組體內(nèi)單個核細胞CD8表達量顯著升高，CD3、CD4表達量顯著降低，CD4/CD8比例顯著降低(P均<0.05)；TH17細胞表達量顯著升高，Treg細胞表達量顯著降低(P均<0.05)；IL-17含量顯著升高，TNF-β含量顯著降低(P均<0.05)；RORγT含量顯著升高，F(xiàn)oxp3含量顯著降低(P均<0.05)。結(jié)論肝癌大鼠TH17/Treg失衡，具體表現(xiàn)為TH17細胞及相關(guān)細胞因子增多，而Treg細胞及相關(guān)細胞因子降低，提示TH17/Treg失衡與肝癌疾病具有相關(guān)性。

〔關(guān)鍵詞〕TH17；Treg；肝癌

肝癌作為胃腸道系統(tǒng)常見腫瘤，與氧自由基、炎性因素、肝組織細胞壞死有密切相關(guān)，越來越多的研究表明免疫系統(tǒng)在肝癌發(fā)病機制中的重要作用〔1〕。TH17及Treg細胞參與多種免疫系統(tǒng)疾病，如多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。近年來發(fā)現(xiàn)，在一些腫瘤患者或是腫瘤模型體內(nèi)，TH17及Treg細胞存在顯著變化，提示TH17及Treg細胞參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔2〕，但國內(nèi)對此兩種細胞是否參與肝癌致病機制仍未有定論，本研究觀察大鼠肝癌模型、TH17/Treg的變化及意義。

1資料與方法

1.1一般資料40只健康雄性Balb/C大鼠，體重(20±4)g，均給予普通食料，在恒溫、固定濕度及良好通風(fēng)條件下飼養(yǎng)。大鼠隨機分為2組，每組20只，對照組、不采取任何干預(yù)措施；肝癌組行大鼠肝癌模型制備。

1.2主要試劑流式抗體CD3抗體，CD4單抗和CD25單抗，IL-17A單抗，F(xiàn)oxp3單抗及FACS透膜劑均購于Ebioscience公司，TRIZOL裂解液、PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)及Takala SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒均購于Takala公司。

1.3肝癌大鼠模型建立大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1 w后，進行模型試驗的制備。取鼠源性p2肝癌細胞株注入大鼠腹腔，待腹水產(chǎn)生后抽取適量腹水，用腹水調(diào)整好肝癌細胞至適當濃度備用。將0.01 ml的癌細胞懸液注入肝臟中，模型制備30 d后，處死大鼠，取脾臟及血液待測。肝內(nèi)注射0.01 ml的生理鹽水作對照組。

1.4脾臟單個核細胞提取大鼠頸椎脫位處死，在無菌環(huán)境下取出脾臟，研磨，并經(jīng)尼龍濾網(wǎng)過濾，收集細胞后離心洗滌，即為脾臟單個核細胞。

1.5T細胞亞群分析取脾臟單個核細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)洗滌，配置成100 μl的單細胞懸液，與用異硫氰酸酯(FITC)或藻紅沅素(PE)標記的流式抗體CD3、CD4、CD8混合，4℃孵育30 min，PBS洗滌2次后，每管加入300 μl的PBS重懸后，上流式細胞儀進行檢測，記錄結(jié)果為陽性細胞所占的比例。

1.6TH17細胞分析取脾臟單個核細胞，PBS反復(fù)洗滌，配制成100 μl的單細胞懸液，向上述懸液中加入FITC標記的抗大鼠CD4單抗10 μl，4℃避光染色30 min。經(jīng)PBS洗滌一次后，應(yīng)用透膜劑，并嚴格按照說明書步驟進行，加入別藻藍蛋白(APC)標記的抗大鼠IL-17A單抗10 μl，混勻后室溫避光孵育30 min，經(jīng)PBS洗滌一次后，加入300 μl溶液，震蕩混勻后，上流式細胞儀檢測。

1.7Treg細胞分析取脾臟單個核細胞，PBS反復(fù)洗滌，配制成100 μl的單細胞懸液，向上述懸液中加入FITC標記的抗大鼠CD4及CD25單抗10 μl，4℃避光染色30 min。經(jīng)PBS洗滌一次后，應(yīng)用透膜劑，并嚴格按照說明書步驟進行，加入APC標記的抗大鼠Foxp3單抗10 μl，混勻后室溫避光孵育30 min，經(jīng)PBS洗滌一次后，加入300 μl溶液，震蕩混勻后，上流式細胞儀檢測。

1.8細胞因子檢測取各組大鼠血清，嚴格按照試劑盒說明書，應(yīng)用白細胞介素(IL)-17及腫瘤壞死因子(TNF)-β 酶聯(lián)免疫試劑盒，檢測上清細胞因子含量。

1.9mRNA 表達檢測實驗所需器械均經(jīng)高壓去RNA酶處理，并經(jīng)0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理，且實驗均在冰塊上操作，降低溫度對結(jié)果的影響。取脾組織，加入1 ml TRIZOL裂解5 min，一次加入三氯甲烷、異丙醇及75%乙醇進行獲取RNA，10 μl DEPC水溶解RNA沉淀，紫外分光光度儀測定濃度及純度。應(yīng)用Takala逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，嚴格按照說明書，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并應(yīng)用TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，進行PCR體系的擴增及反應(yīng)。其中，引物序列為：β-actin：5'-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3'和5'-TGTGGACTTGGGAGAGGACT-3'；Foxp3：5'-GCACAAGTGCTTTGTGCGAGT-3'和5'-TGTCTGTGGTTGCAGACGTTAT-3'；RORγT：5'-GCA GCG CTC CAA CAT CTT CT-3'和5'-ACG TAC TGA ATG GCC TCG GT-3'，試驗時每個樣本和基因做2個相同的復(fù)孔。

1.10統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2結(jié)果

2.1兩組T細胞亞群分析與對照組相比，肝癌組單個核細胞CD8表達量顯著升高，CD3、CD4表達量顯著降低，CD4/CD8比例顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1兩組體內(nèi)T細胞亞群分析(x±s,n=20)

組別CD3(%)CD4(%)CD8(%)CD4/CD8肝癌組43.2±10.31)30.9±16.11)49.3±10.51)0.9±0.71)對照組60.1±11.740.7±15.326.7±10.81.6±0.8

與對照組比較:1)P<0.05

2.2兩組TH17/Treg亞群分析與對照組〔(44.2±13.6)%，(54.9±12.1)%〕相比，肝癌組CD4+IL-17+T細胞(TH17細胞)表達量〔(63.7±14.9)%〕顯著升高，CD4+CD25+Foxp3+T細胞(Treg細胞)表達量〔(41.3±11.6)%〕顯著降低(P<0.05)。

2.3兩組細胞因子分泌水平與對照組〔(155.6±13.6)，(341.3±27.6)pg/ml〕相比，肝癌組IL-17含量〔(274.2±14.7)pg/ml〕顯著升高，TNF-β含量〔(154.9±22.1)pg/ml〕顯著降低(P<0.05)。

2.4兩組對象轉(zhuǎn)錄因子表達與對照組相比，肝癌組RORγT含量(3.0±0.4 vs 1)顯著升高，F(xiàn)oxp3含量(0.5±0.6 vs 1)顯著降低(P<0.05)。

3討論

肝癌發(fā)病率及致死率分居惡性腫瘤的第五位和第三位，多種致病因素均可誘導(dǎo)其發(fā)病，其確切病因至今未明，機體的免疫狀態(tài)及分子免疫與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，病毒感染多是肝癌發(fā)生的基礎(chǔ)，造成慢性肝損傷促進肝硬化的發(fā)生，與此同時，炎癥的介入則促進了肝癌進展〔3〕。多種炎癥細胞和炎癥因子組成的炎癥微環(huán)境在肝癌進展中發(fā)揮重要作用。腫瘤相關(guān)性巨噬細胞作為一種異質(zhì)性細胞，是含量最高的炎性細胞，在疾病進展中起重要作用；髓系抑制性細胞是樹突細胞及巨噬細胞的前體，具有較強的免疫抑制功能；多種炎性因子，如IL-1，IL-6，IL-10也可通過多種機制來影響肝臟疾病的發(fā)生及發(fā)展〔4～6〕。

TH17及Treg細胞具有獨立的分化和調(diào)節(jié)機制，且互相抑制，TH17的產(chǎn)生可抑制Treg的分化及發(fā)育，兩者可經(jīng)過多種途徑影響和參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。在機體正常穩(wěn)態(tài)下，TH17及Treg細胞保持動態(tài)平衡，以利于機體多種免疫反應(yīng)〔7〕。TH17/Treg失衡則導(dǎo)致炎性反應(yīng)過度，參與病毒性肝炎、肝病及肝癌的發(fā)生。在慢性乙型肝炎患者外周血中，TH17細胞及分泌的相關(guān)細胞因子均增高，與此同時，Treg細胞及分泌的相關(guān)細胞因子均降低，且此種現(xiàn)象也出現(xiàn)在慢性乙型肝炎病毒攜帶者、靜止性及活動性肝硬化疾病中，TH17及Treg細胞均可出現(xiàn)不同程度的變化〔8～10〕。本文提示，TH17及Treg細胞均從不同方面參與了肝癌疾病的進展中，TH17細胞具有促進腫瘤發(fā)生發(fā)展，增多的機制可能與腫瘤細胞可分泌多種TH17增殖及分化的細胞因子。而IL-17細胞的增多反過來同時抑制了Treg細胞的生成和分化〔11〕，從而導(dǎo)致抗腫瘤免疫的減弱。

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〔2014-12-15修回〕

(編輯苑云杰)

〔中圖分類號〕R735.7

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1828-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.016

基金項目：延吉市衛(wèi)生局和計劃生育局地區(qū)科學(xué)基金項目(No.81160476)

1延邊大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)科

第一作者：黃剛哲(1964-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事老年科疾病研究。