丁苯酞對阿爾茨海默病大鼠海馬p38絲裂原激活蛋白激酶和細胞外信號調節激酶表達的影響

齊凡星　胡　瑩　劉　潔　康麗娟　張會朵

(保定市第一中心醫院神經內二科，河北　保定　071000)

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丁苯酞對阿爾茨海默病大鼠海馬p38絲裂原激活蛋白激酶和細胞外信號調節激酶表達的影響

齊凡星胡瑩1劉潔康麗娟張會朵

(保定市第一中心醫院神經內二科，河北保定071000)

〔摘要〕目的探究丁苯酞對阿爾茨海默病(AD)大鼠海馬區中p38絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)和細胞外信號調節激酶(ERK)表達的影響。方法雄性成年SD大鼠90只隨機分為試驗組、對照組和空白組各30只，在試驗組和對照組大鼠海馬區內注射Aβ1～42建立AD模型，建模后第2天開始給予試驗組丁苯酞灌胃，對照組和空白組給予相同劑量的食用麻油，共喂養30 d。之后通過Y型迷宮比較三組學習記憶能力，通過免疫組織化學染色方法比較三組腦組織中p38MAPK和ERK的表達水平。結果三組學習記憶能力由強到弱依次為空白組，試驗組和對照組；三組CA1海馬區p38MAPK表達陽性的細胞數量由高到低依次為對照組、試驗組和空白組；三組大腦皮層中ERK表達水平由高到低依次為空白組，試驗組和對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論丁苯酞可明顯改善AD大鼠的學習記憶能力，其原因可能與海馬區p38MAPK表達下降及大腦皮層中ERD表達提高有關。

〔關鍵詞〕丁苯酞；阿爾茨海默?。籶38絲裂原激活蛋白酶(MAPK);細胞外信號調節激酶(ERK)

tau等蛋白過度磷酸化可導致大腦神經元纖維纏結，后者所占全部神經元的比例與阿爾茨海默病(AD)患者的癥狀呈正相關〔1〕。而包括p38在內的多種絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)及細胞外信號調節激酶(ERK)可通過調控tau等蛋白的磷酸化達到改善癡呆程度的目的〔2〕。丁苯酞具有降低tau蛋白磷酸化的功能〔3〕，本研究研究丁苯酞對AD模型大鼠海馬p38MAPK和ERK表達的影響。

1資料與方法

1.1實驗動物及分組北京大學醫學院實驗動物中心提供的雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠90只隨機分為試驗組、對照組和空白組各30只。所有SD大鼠均健康，試驗組平均體質量(232.63±7.55)g，對照組(233.64±7.47)g，空白組(232.89±7.61)g，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2實驗設備及試劑10%水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司/國藥準字：p7022673)；Aβ1～42購自Sigma公司；丁苯酞(石藥集團恩必普藥業有限公司/國藥準字：p0050298)；p38MAPK抗體、ERK抗體及相關染色試劑購自重慶威斯騰生物醫藥科技有限公司；全自動免疫組織化學染色儀MY2300購自澳大利亞郝思林公司。

1.3大鼠AD模型制備試驗組和對照組腹腔注射10%水合氯醛麻醉，劑量0.5 ml/100 g。麻醉成功后定位大鼠雙側海馬區，向其分別注射5 μl(1 μg/μl)Aβ1～42。

1.4試驗過程及切片制備將丁苯酞與食用麻油按0.1 g/12.5 ml的比例混合配制成懸濁液。自建模第2天開始，給予試驗組上述懸濁液灌胃治療，劑量為75 mg/kg。給予對照組和空白組等容積的食用麻油灌胃，1次/d，共喂養30 d。30 d后，應用Y型電迷宮對學習記憶能力進行測定，具體為：讓大鼠在Y型電迷宮內適應5 min后，人為選取一個安全區，當大鼠移動到非安全區時給予電擊同時安全區燈亮，若大鼠未移動至安全區繼續重復上述指令至大鼠移動至安全區。反復訓練至僅在安全區燈亮，無電刺激時大鼠即移動至安全區，電迷宮試驗停止〔4〕。之后給予所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，劑量1.0 ml/100 g。麻醉成功后，剖胸暴露心臟，自左心室灌注200 ml的0.9%生理鹽水后繼續灌注4%多聚甲醛。同時迅速切開顱骨取出腦組織，經固定、脫水、石蠟包埋后制得厚度約5 μm切片。

1.5免疫組織化學測定切片脫蠟處理后首先于75℃的枸櫞酸鈉溶液中浸泡15 min。之后用0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗15 min。再經20%過氧化氫室溫浸泡10 min后用蒸餾水沖洗兩次，每次15 min。滴加p38MAPK抗體(1∶300)和ERK抗體(1∶400)后于2℃環境下放置12 h，之后滴加染色試劑ABC后在配套顯色盒下顯色。

1.6觀察指標①電迷宮試驗停止時大鼠接受電刺激的次數；②于低倍鏡和高倍鏡下觀察CA1海馬區和皮質區內p38MAPK和ERK陽性細胞的數量：以染色呈紅棕色作為判定細胞陽性的標準，每個區域取兩張切片在高倍鏡下計算其平均值作為最終陽性細胞的數量。

1.7統計學方法采用SPSS18.0統計軟件進行t檢驗。

2結果

2.1三組學習記憶能力比較建模前對照組、試驗組和空白組在Y型電迷宮試驗中接受電刺激的次數〔(15.77±2.73)、(15.78±2.65)、(15.49±2.62)次〕差異無統計學意義(P>0.05)。治療30 d后，三組接受電刺激的次數由多到少依次為對照組〔(23.78±4.75)次〕，試驗組〔(18.31±2.73)次〕和空白組〔(15.98±2.67)次〕(P<0.05)，見表1。

2.2三組切片中p38MAPK和ERK表達情況比較在光學顯微鏡下觀察，三組CA1海馬區p38MAPK表達陽性的細胞數量由高到低依次為對照組(52.81±6.73)，試驗組(38.69±7.32)和空白組(21.35±4.22)(圖1)，差異有統計學意義(P<0.05)。三組大腦皮層中ERK表達水平由高到低依次為空白組(48.39±7.27)，試驗組(32.75±5.38)和對照組(18.71±4.42)(圖2)，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1　三組切片中p38MAPK表達情況

圖2　三組切片中ERK表達情況

3討論

大腦彌散性萎縮和神經細胞變性是AD的主要病理改變〔5，6〕。以p38為代表的MAPK及ERK在腦組織中表達的水平與癡呆的程度呈現明顯的相關性〔7〕。慢性炎癥反應造成的神經元不可逆變性被認為是AD形成的重要因素，而p38MAPK和ERK在促炎及抗炎的平衡中行使重要功能〔8〕。p38MAPK可通過介導炎癥因子中的白細胞介素-1和腫瘤壞死因子-α生成，從而加重炎癥反應，而后者又可通過促進小膠質細胞釋放p38MAPK使其正反饋通路不斷擴大〔9〕。此外，小膠質細胞本身可以釋放其他炎癥因子和超氧自由基，小膠質細胞的激活將炎癥反應進一步放大，最終加速腦部神經元的不可逆變性。傳統觀點認為ERK信號通路主要與神經元的增殖、分化及損傷后的修復有關，但最新研究〔10〕發現許多分化成熟的神經元中仍有大量ERK及相應的靶蛋白存在，因此一部分學者〔11〕傾向于將ERK信號通路活躍視為神經元存活的指標。丁苯酞除此之外還具有降低tau蛋白磷酸化的效果〔12〕。

本試驗提示丁苯酞在改善AD大鼠的認知功能上效果顯著，與Peng等〔13〕的研究結論相一致。可推測Aβ1～42可通過介導p38MAPK的過表達觸發炎癥反應的正反饋通路，而丁苯酞抑制tau蛋白磷酸化的作用機制主要通過阻斷p38MAPK過表達來實現。ERK的過表達對神經元起保護作用并參與了學習記憶形成的過程，而丁苯酞通過促進小膠質細胞分泌ERK從而達到延緩AD進程的目的。然而Aβ1～42所得AD大鼠模型與人神經元長期慢性炎癥所致的不可逆變性仍存在較大差異〔14〕，將丁苯酞應用于AD患者仍需要更加深入研究。

4參考文獻

1侯德仁，田怡，周軍，等.丁苯酞對阿爾茨海默病模型大鼠P38及ERK表達的影響及意義〔J〕.南方醫科大學學報，2009;29(8)：1592-5.

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3張會凱，張曉煒，王珊，等.丁苯酞對Aβ1-42致AD大鼠海馬p38MAPK表達的影響〔J〕.中風與神經疾病雜志，2013;30(8)：681-4.

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9李自如，高彩云，袁軍.丁苯酞治療血管性認知功能障礙患者的臨床療效〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(3):606-8.

10侯德仁，田怡，周軍，等.丁苯酚對阿爾茲海默病模型大鼠P38及ERK表達的影響及意義〔J〕.南方醫科大學學報，2009；29(8)：1592-5.

11曹燕，王旭，梁楓.認知功能障礙相關信號通路〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(21)：6295-7.

12邵小鵬，桂樹華，胡玲玲.丁苯酞治療老年血管性癡呆的臨床療效及對精神心理量表的影響〔J〕.中國老年學雜志，2013;33(22)：5601-2.

13Peng Y,Xing C,Lemere CA,etal.1-3-n-Butylphthalide.ameliorates.beta-amyloid-induced neuronal toxicity in cultured neuronal cells〔J〕.Neurosci Lett,2008;434(2):224-9.

14Akiyama H,Barger S,Barnum S,etal.Inflammation and Alzheimer disease〔J〕.Neurobiol Aging,2000;21(3):383-421.

〔2014-11-25修回〕

(編輯苑云杰)

〔中圖分類號〕R742

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1834-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.019

基金項目：保定市科學研究與發展計劃項目(No.20151643)

1保定市第一中心醫院心內三科

第一作者：齊凡星(1982-)，男，碩士，主治醫師，主要從事神經內科疾病研究。