基質細胞衍生因子-1對大鼠視網膜血管內皮細胞功能的影響及其與MAPK/Erk信號通路的關系

鄢燕瓊　陳傳綺　郭鐵成　鐘曉紅　羅千軍　高　文　莊　嚴

(深圳市蛇口人民醫院，廣東　深圳　518067)

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基質細胞衍生因子-1對大鼠視網膜血管內皮細胞功能的影響及其與MAPK/Erk信號通路的關系

鄢燕瓊陳傳綺郭鐵成鐘曉紅羅千軍高文莊嚴

(深圳市蛇口人民醫院，廣東深圳518067)

〔摘要〕目的探討基質細胞衍生因子(SDF)-1及MAPK/Erk信號通路抑制劑U0126對體外培養的大鼠視網膜血管內皮細胞(MRVEC)增殖的影響。方法體外培養的MRVEC采用0、25、50和100 μg/L的SDF-1處理，100 μg/L SDF-1處理體外培養的MRVEC細胞0、24、48和72 h，采用Western印跡方法檢測MRVEC細胞中MAPK/Erk信號通路的磷酸化活化情況，采用四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)檢測MRVEC細胞的增殖情況。采用MAPK/Erk信號通路抑制劑U0126預處理MRVEC細胞，觀察MAPK/Erk信號通路在SDF-1調控MRVEC細胞增殖中的作用。結果與100 μg/L的SDF-1處理組相比，25、50和100 μg/L的SDF-1均可顯著上調MRVEC細胞中Erk的磷酸化水平，加強MRVEC細胞的增殖能力(P<0.01)，且這種作用具有劑量依賴性。采用Erk信號通路阻斷劑U0126阻斷MRVEC細胞中的Erk信號通路后，SDF-1促MRVEC細胞增殖的能力顯著降低(P<0.01)。結論胰島素可通過激活MRVEC細胞中的MAPK/Erk信號通路，進而增強MRVEC細胞的增殖能力，從而在糖尿病視網膜病變中發揮一定的作用。

〔關鍵詞〕基質細胞衍生因子-1；視網膜血管內皮細胞；糖尿病；增殖

糖尿病(DM)患者常伴有的微血管病變主要包括DM視網膜病變(DR)和DM腎病(DN)等，DR可導致DM患者視力喪失〔1〕。DR的機制目前研究還不是很清楚。基質細胞衍生因子(SDF)-1是一種重要的血管生成蛋白，也被稱為CXCL12〔2，3〕，其受體為CXCR4。SDF-1 及其受體CXCR4可通過促進內皮祖細胞(EPC)從骨髓移向缺血的視網膜，從而促使視網膜受損血管的修復和新生〔4〕。然而，SDF-1在調控DM患者DR發生中的作用機制還不是很清楚。本文旨在探討SDF-1對大鼠視網膜血管內皮細胞(MRVEC)增殖的影響及其相關機制。

1材料與方法

1.1MRVEC獲取與處理MRVEC獲取及鑒定方法參見文獻報道〔5〕，細胞于37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養。活化實驗中采用0、25、50、100 μg/L的SDF-1及100 μg/L的SDF-1處理MRVEC 0、24、48和72 h。

1.2細胞總蛋白提取將處理后的MRVEC采用冰磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后離心5 min；離心后將上清液吸去獲得細胞沉淀，將蛋白磷酸酶抑制劑與100 μl CytoBuster蛋白提取試劑加入細胞沉淀后，采用高速渦旋進行細胞裂解25 s，并于室溫下靜置15 min；再次離心15min；離心后取上清部分即為細胞總蛋白。取出部分檢測蛋白濃度，剩余細胞總蛋白采用15 μl管分裝并于-80℃凍存。

1.3BCA法測定蛋白濃度將標準品BSA進行倍比稀釋，操作按照說明書進行。取BCA試劑A與試劑B混合，比例按照體積比50∶1混合后得到工作液。依次取200 μl工作液加入96孔板中，后加入25 μl倍比稀釋的標準品或待測樣品。每種樣品應采用3復孔。加入完畢后于37℃下孵育30 min，并采用振蕩器進行短暫混合。采用波長562 nm進行OD值測定；根據檢測結果，采用標準品光密度值與濃度梯度數據進行標準曲線繪制，并根據標準曲線及所測得的待測樣品OD值計算出各樣品中蛋白濃度。

1.4Western印跡提取等量蛋白并采用濃度為8%～10%的SDS-PAGE分離膠與濃度為5%的濃縮膠進行分離，在半干狀態下轉印到硝酸纖維素膜上，并采用濃度為5%的TBST于室溫下封閉60 min后，加入一抗，并于4℃下進行過夜孵育。次日將孵育后的產物采用濃度為0.1%的TBST進行洗膜，共洗滌3次，5 min/次。洗滌完畢后加入HRP標記的二抗，并于室溫下孵育60 min。孵育后采用濃度為0.1%的TBST洗膜1次，選擇Supersignal West Femto/Pico HRP敏感化學發光底物對硝酸纖維素膜進行顯色。采用β-actin作為對照。以上實驗重復至少3次以上。

1.5四甲基偶氮唑藍比色(MTT)檢測增殖將上述SDF-1處理過的MRVEC，培養至對數生長期時接種至96孔培養板。然后依次取20 μl的MTT加入培養板每孔中。充分作用4 h。將上清液吸去，并加入150 μl的DMSO。采用振蕩器于低速下振蕩10 min，采用490 nm波長測定OD值。對于阻斷MAPK/ErK信號通路實驗，先采用10 μmol/L的U0126將細胞預處理60 min后再加入完全培養基與SDF-1。

1.6統計學方法采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2結果

2.1MRVEC的鑒定如圖1所示，培養至14 d的MRVEC呈鋪路石樣生長；同時，MRVEC Ⅷ因子胞質染色呈綠色熒光，Hochest核染色呈藍色熒光，證明培養的細胞確實為MRVEC，可用于后續的實驗研究。

2.2SDF-1對MRVEC細胞中Erk蛋白磷酸化水平的作用MRVEC細胞中ErK蛋白磷酸化水平與SDF-1濃度及處理時間呈正相關關系。見圖2。

2.3SDF-1對MRVEC細胞增殖的作用隨著SDF-1濃度的升高和處理時間的延長，MRVEC細胞增殖能力逐漸升高(P<0.01)(圖3)。

2.4Erk信號通路在SDF-1促MRVEC細胞增殖中的作用同SDF-1處理組(3.22±0.86)相比，阻斷MRVEC細胞中Erk信號通路后，MRVEC細胞增殖能力顯著降低(0.63±0.47)(P<0.01)，對照組為0.58±0.23(圖4)。

圖1　MRVEC的鑒定結果

圖2　Western印跡檢測SDF-1對MRVEC細胞中Erk蛋白磷酸化水平的影響

A.不同濃度SDF-1處理MRVEC細胞；B.100 μg/L的SDF-1處理MRVEC細胞不同時間圖3　MTT方法檢測SDF-1對MRVEC細胞增殖的影響

3討論

SDF-1是新近發現的一種趨化因子，和CXCR4共同構成特異性的SDF-1/CXCR4軸〔6,7〕。目前已知SDF-1在促進視網膜新生血管的發生和發展中具有重要的作用。林安華等〔8〕研究發現，SDF-1可通過調節CXCR4和VEGF的表達，進而參與DR的發生和發展。此外，SDF-1 及其受體CXCR4可通過促進EPC從骨髓移向缺血的視網膜處募集，從而促使視網膜受損血管的修復和新生〔4〕。據此，SDF-1在DR的發生發展中具有重要的作用。本研究結果提示，SDF-1是通過調控MAPK/Erk信號通路的活化而促進MRVEC增殖。DR發生發展的影響機制可能是通過激活MRVEC中的MAPK/ErK信號通路，從而起到增強MRVEC增殖能力的作用。本研究為臨床干預SDF-1/CXCR4 軸，從而治療DR提供一定的理論基礎。

4參考文獻

1Sivack-Calleott JA，O′Day DM，Gass DM，etal.Evidence-based recommendations for the diagnosis and treatment of neovascular glaucoma〔J〕.Ophthalmology，2001；108(10)：1767-76.

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3Errede M，Girolamo F，Rizzi M，etal.The contribution of CXCL12-expressing radial glia cells to neuro-vascular patterning during human cerebral cortex development〔J〕.Front Neurosci，2014；15(8)：324.

4馬曉昀，徐格致.基質細胞衍生因子-1與增生性糖尿病視網膜病變的研究進展〔J〕.世界臨床藥物，2007；28(7)：394-403.

5崔錚，閆淑，劉榮，等.鼠視網膜血管內皮細胞體外培養的改良及鑒定〔J〕.中國實驗眼科雜志，2011；29(2)：118-20.

6Wei L，Zhang B，Cao W，etal.Inhibition of CXCL12/CXCR4 suppresses pulmonary arterial smooth muscle cell proliferation and cell cycle progression via PI3K/Akt pathway under hypoxia〔J〕.J Recept Signal Transduct Res，2014；25：1-11.

7Abu El-Asrar AM，Mohammad G，Nawaz MI，etal.High-mobility group box-1 modulates the expression of inflammatory and angiogenic signaling pathways in diabetic retina〔J〕.Curr Eye Res，2014；11：1-12.

8林安華，雷閩湘，張朝云，等.基質細胞衍生因子-1α對牛視網膜血管內皮細胞CXCR4和VEGF表達的影響〔J〕.眼科新進展，2009；29(11)：821-4.

〔2015-10-12修回〕

(編輯滕欣航)

〔中圖分類號〕R587

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1836-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.020

第一作者：鄢燕瓊(1976-)，女，碩士，主治醫師，主要從事糖尿病、甲狀腺疾病方面研究。