C19、C27多肽對人主動脈平滑肌細胞的趨化活性

宣成睿　沈晨陽

(內蒙古醫科大學病理生理教研室，內蒙古　呼和浩特　010059)

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·經驗交流·

C19、C27多肽對人主動脈平滑肌細胞的趨化活性

宣成睿沈晨陽1

(內蒙古醫科大學病理生理教研室，內蒙古呼和浩特010059)

〔關鍵詞〕趨化素樣因子1；血管平滑肌細胞；趨化作用；動脈粥樣硬化

趨化因子超家族(CKLFSF)在人類有九個成員，即：趨化素樣因子(CKLF)和CKLFSF1～8。該基因家族的基因編碼的產物特點為其結構介于經典的趨化因子和四次跨膜蛋白之間。CKLF1具有CC 家族趨化因子的結構特征和基本功能，即連續兩個半胱氨酸的特征性結構和趨化功能〔1〕。本研究選擇CKLF1 C端的兩段多肽——C19、C27多肽，體外觀察二者對人主動脈平滑肌細胞的趨化活性。

1材料和方法

1.1主要試劑和材料達爾伯克氏改良伊格爾培養基(DMEM)購自Gibco公司，胎牛血清(FBS，Gibco公司)，單克隆小鼠抗人平滑肌α-actin抗體(北京中衫金橋生物有限公司)。磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)、枸櫞酸鈉抗原修復液(pH 6.0，北京鼎國生物技術有限責任公司)。蘇木素、伊紅、分化液、返藍液(北京天合力恩化學試劑公司)。C19,C27多肽由北京大學醫學部免疫實驗室韓文玲教授惠贈，Transwell(Costar公司)。

1.2細胞培養動脈血管的取材來自肝移植手術供體的髂動脈.采用組織貼塊法培養動脈平滑肌細胞。細胞培養：在無菌的條件下將動脈外膜撕去，用刀片刮除血管內皮細胞，將血管中膜剪成 1.5 mm×1.5 mm 鋪置無菌培養瓶底，組織塊間距離不超過0.5 cm，瓶底朝上，向培養瓶中加入5～6 ml 含20%FBS體積分數DMEM培養液，置于37℃孵箱，6～8 h后將其緩慢翻轉平放，使組織塊完全浸入培養液中。當一些組織塊周圍細胞生長相當密集以致失去特有的梭形形態時，按1∶1或 1∶2進行傳代。實驗過程中選用3～6代細胞。

1.3細胞鑒定使用倒置相差顯微鏡觀察動脈平滑肌細胞行形態學鑒定,并用α-actin 行免疫組織化學染色鑒定。

1.4實驗分組及方法趨化實驗在24孔Transwell趨化小室中進行，微孔濾膜為聚碳酸酯膜(PC),孔徑為8 μm。小室下層分別加入對照組10%FBS的DMEM培養基，實驗組1：10%FBS的DMEM培養基稀釋C19，多肽片段的終濃度為10%，實驗組2：10%FBS的DMEM培養基稀釋C27，多肽片段的終濃度為10%。每組設3個復孔。將培養的動脈平滑肌細胞消化離心，用0.5%牛血清白蛋白DMEM培養液重懸，細胞數調整為2×106/ml，小室上層每孔加入0.1 ml細胞懸液。將小室放入37℃，5%CO2孵箱孵育8 h后取出小室，用棉簽擦去未遷移的細胞，PBS沖洗3次。用4%多聚甲醛固定20 min,將小室晾干后行結晶紫染色30 min。取下膜，封片。光鏡下觀察，隨機選取3個高倍視野，計算遷移細胞數。

1.5統計學方法采用SPSS13.0軟件進行t及q檢驗。

2結果

2.1細胞鑒定結果光鏡下細胞胞質內出現大量的向細胞兩極呈放射狀的肌絲，縱向平行排列有密區，α-actin免疫組織化學染色結果顯示95%細胞胞質呈棕色染色〔抗平滑肌細胞(SMC)陽性〕，證明培養的為平滑肌細胞且純度較高。見圖1。

圖1　α-actin免疫組織化學染色結果(×200)

2.2C19、C27 對人動脈平滑肌細胞趨化實驗結果對照組遷移細胞數(9±2),實驗組1(C19)遷移細胞數(16±3)，趨化指數是1.8(P<0.05)，實驗組2(C27)遷移細胞數(28±4)趨化指數是3.1(P<0.01)。兩實驗組趨化細胞數目差異顯著(P<0.01)。

3討論

動脈粥樣硬化(AS)由脂質、碳水化合物、血液成分的灶狀沉積,結締組織和鈣沉積所致的,伴有動脈中膜改變的聯合病變。目前認為AS的發生是多種致病因素共同作用的結果，其中包括平滑肌細胞，巨噬細胞及T淋巴細胞的聚集；膠原、彈性纖維、蛋白質多糖等結締組織基質和平滑肌細胞的增生；脂質的沉積等。作為血管中層唯一細胞成分的平滑肌細胞向內膜的遷移、增殖在AS發生、發展整個過程中都起到至關重要的作用。CKLF1與以往發現的大部分趨化因子在功能上有很大的差異。大部分CC家族趨化因子只對單核細胞和淋巴細胞有趨化活性，對中性粒細胞沒有作用，CKLF1可以趨化單核細胞、淋巴細胞、中性粒細胞，是CC趨化因子受體(CCR)4的功能性配體。CKLF1的C 端多肽C19、C27是將果蠅表達系統分泌表達的CKLF Ⅰ蛋白,進行N 端測序得到的兩種CKLF1分泌形式,位于CKLF1的C端,命名為C19 、C27 多肽〔2〕。趨化分析顯示CKLF1-C19 對人外周血淋巴細胞和單核細胞具有一定的趨化活性;而CKLF1-C27只對單核細胞具有趨化活性;但它們均不能趨化人外周血中性粒細胞〔3〕。此外，王嬌莉等〔4〕研究發現，利用化學合成的CKLF1 C端肽C19,C27對CCR4、CCR5轉染細胞具有趨化作用,C19 趨化活性較弱。本實驗發現多肽片段C19、C27對于人離體平滑肌細胞均有一定旳趨化作用，并且多肽C27的趨化活性強于多肽C19，其原因可能是與CKLF1-C27相比,CKLF1-C19缺少CKLF1-C27的N端8個氨基酸相關〔5〕。至于C19與C27多肽片段之間是否也存在相互作用，需實驗進一步證明。

4參考文獻

1韓文玲,李瑩,馬大龍,等.利用抑制性減數雜交(SSH) 研究IL-10抑制表達的新基因〔J〕.中華微生物學和免疫學雜志,2000；20(2):128-31.

2王應,殷彩花,張穎妹,等.CKLF1C末端肽與多種趨化因子受體相互作用〔C〕.北京：中國免疫學會第五屆全國代表大會暨學術會議，2006：223-4.

3李婷,張穎妹,鐘吉,等.人趨化素樣因子1C端活性多膚CKLF1-C19和CKLF1-C27 的功能研究〔C〕.北京：中國免疫學會第五屆全國代表大會暨學術會議,2006:72.

4王嬌莉,沈華浩,王應.趨化素樣細胞因子1C端肽C19、C27干預對哮喘小鼠氣道炎癥、黏液分泌及氣道反應性的影響〔C〕.湖州：華東地區第6屆中青年呼吸醫師論壇暨浙江省第29屆呼吸疾病學術年會論文，2007：358-63.

5王應,馬大龍.新細胞因子趨化素樣因子(CKLF1)的發現與新藥開發〔J〕.中國藥學雜志,2011；46(4):241-4.

〔2015-02-16修回〕

(編輯安冉冉/杜娟)

〔中圖分類號〕R543.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-2002-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.102

通訊作者：沈晨陽(1968-)，男，教授，主要從事血管外科疾病研究。

基金項目：國家自然科學基金資助項目(30672039)

1北京大學人民醫院血管外科

第一作者：宣成睿(1978-)，女，副教授，碩士，主要從事心腦血管疾病的研究。