hGITRL在食道癌組織中的表達及臨床意義

李志祥　錢　軍　張立功

(蚌埠醫學院第一附屬醫院腫瘤外科,安徽　蚌埠　233000)

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hGITRL在食道癌組織中的表達及臨床意義

李志祥錢軍張立功

(蚌埠醫學院第一附屬醫院腫瘤外科,安徽蚌埠233000)

〔摘要〕目的探討食道癌的腫瘤壞死因子受體配體(hGITRL)表達差異的臨床病理相關性及其在預測患者預后中的臨床指導價值。方法采用Western印跡方法檢測112例食道癌臨床組織樣本和101例配對癌旁食道hGITRL的蛋白表達，酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測38例食道癌患者、12例食道異常增生患者和20例健康自愿者的血清hGITRL蛋白水平，分層分析與食道癌病理參數的相關性，進一步生存分析hGITRL表達與臨床預后的關系。結果食道癌組織中hGITRL蛋白條帶灰度值較癌旁食道組織顯著增高(P<0.001)，且血清hGITRL陽性率為食道癌>食道異常增生>正常食道(P<0.05)；食道癌hGITRL的高表達與淋巴結轉移和臨床分期顯著相關(P<0.001)；進一步生存分析發現hGITRL陽性表達者的3年、5年無瘤生存率和生存期，均較陰性者明顯降低(P<0.05)，Cox生存風險模型示hGITRL可能是食道癌患者3年無瘤生存預后的獨立危險因素(P=0.029，<0.05)。結論hGITRL可能成為食道癌早期診斷的生物學標志物，且可能具有預測食道癌患者3年無瘤生存預后的重要臨床價值，但尚待大樣本臨床研究證實。

〔關鍵詞〕hGITRL；食道癌；早期診斷；預后

目前認為食管癌發生與多因素、多階段和多基因變異及其相互作用密切相關，其中分子水平上的癌基因、抑癌基因及其蛋白質變化尤為重要〔1〕。糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子(TNF)受體(GITR)及其配體(GITRL)是最近發現的TNF受體/配體超家族成員之一，主要對調節性和效應性T細胞進行調控。目前發現，hGITRL主要高表達于血管內皮細胞或抗原提呈細胞及一些腫瘤細胞表面，而靜息性和活化的T細胞不表達〔2〕。在對hGITRL突變體的功能研究中發現突變除了會影響GITRL與GITR的結合外，還影響了T細胞增殖〔3〕。也有研究發現了GITRL基因多態性與消化道腫瘤發生發展的相互關系〔4〕。最近報道提示GITRL可能作為一種致癌基因，參與了結直腸癌的發生過程〔5〕。由于目前尚無hGITRL基因與食道癌發生發展的研究報道，本研究旨在探討hGITRL表達在食道癌發生發展、臨床病理及其預后方面的臨床意義。

1資料和方法

1.1臨床資料收集本院2008年2月至2013年1月接受食道癌根治術的患者112例，并成功獲得相應配對的癌旁食道組織101例；同時獲得38例食道癌、12例食道異常增生(男7例，女5例，≥60歲5例，<60歲7例)和20例正常健康自愿者(男11例，女9例，≥60歲6例，<60歲14例)的外周血血清樣本；所有食道癌患者均經術后病理組織外科檢查確診，食道異常增生患者經胃鏡鉗取和病檢確診；納入患者卡氏功能狀況評估量表(KPS)均在60～80分之間。五組樣本的人口統計學和臨床病理參數等資料詳見表1。本研究納入患者均簽署知情同意書，并經本院倫理委員會批準。

1.2Western印跡檢測從食道癌根治術中獲得的食道癌和癌旁組織樣本放入凍存管并于液氮中保存，取出后液氮研磨，最后將RIPA蛋白裂解液處理后離心獲得的上清液移入EP管中待蛋白濃度測定。通過標準曲線分析不同臨床樣本的蛋白質濃度，并將蛋白濃度調至一致后等量加入聚丙烯酰胺漿凝膠電泳(PAGE)膠點樣孔中，指示線跑至底部時終止電泳，組裝轉膜三明治并放入轉膜儀中，在100V、100 min后終止轉膜，洗膜后5%脫脂牛奶封閉膜(搖床1 h)，隨后加入一抗4℃孵育過夜(β-actin 1∶1 000：購于聯科生物有限公司；hGITRL 1∶2 000：購于abcam公司)，復溫30 min后洗膜，再加入用5%脫脂牛奶稀釋的二抗孵育，室溫1 h，洗膜后化學發光處理，并采用凝膠圖像分析儀曝光和圖像保存。最終條帶灰度值采用image J軟件進行分析。

表1各組樣本的人口統計學及臨床資料(n)

項目食道癌組織(n=112)癌旁食道組織(n=101)食道癌血清(n=38)性別(男/女)68/4460/4121/17年齡(歲)≥60625520<60504618腫瘤部位上段29258中段444018下段393612病理類型鱗癌1029235腺癌1093分化程度高-中635921中-低494217淋巴結轉移有585419無544719臨床分期Ⅰ～Ⅱ期534516Ⅲ～Ⅳ期595622

1.3酶聯免疫吸附法(ELISA)0.05 mol/L碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至1～10 μg/ml，每一反應孔加0.1 ml且4℃過夜，而后棄去孔內液體，洗滌緩沖液洗3 min，共3次；加待檢樣品0.1 ml于已包被反應孔中，37℃孵育60 min后洗滌；于各反應孔中加酶標抗體0.1 ml。37℃孵育30～60 min后洗滌；于各反應孔中加TMB底物溶液0.1 ml以顯色，37℃孵育10～30 min；于各反應孔中加2 mol/L硫酸0.05 ml終止顯色反應；于450 nm波長處在ELISA檢測儀上進行各反應孔的OD值測定，若大于陰性對照OD值的2.1倍或以上，即視為蛋白表達陽性。

1.4隨訪本研究納入的112例食道癌患者均參加了3年及5年的無瘤生存預后監測，無失訪者，隨訪率達100%，隨訪包括術后和(或)輔助治療后3年和5年的復發、轉移或死亡等情況發生情況，并均記為終點事件，隨訪以門診或電話聯系等方式為主。

1.5統計學方法采用SPSS11.5軟件進行t檢驗或ANOVA方差分析、χ2檢驗。采用Kaplan-Meier壽命表法并繪制生存曲線，用Log-rank檢驗和Cox生存風險模型。

2結果

2.1食道癌組織中的hGITRL蛋白高表達食道癌組織中的hGITRL蛋白表達條帶灰度值為(210.66±74.32)，較癌旁食道組織的(104.29±55.85)顯著增高(t=11.707，P=0.000)。

2.2不同血清樣本的hGITRL蛋白陽性率比較食道癌患者血清中hGITRL陽性率為89.5%(34/38)，食道異常增生患者陽性率為58.3%(7/12)，健康自愿者陽性率為15.0%(3/20)，

三組比較均有統計學差異(χ2=31.256，P=0.000)，且兩兩比較也均有統計學差異(P<0.05)。

2.3hGITRL表達與臨床病理參數的相關性將112例食道癌患者的蛋白條帶灰度值的均值210.66設為臨界值，所有≥此值的視為陽性表達者，余下則為陰性表達者。結果顯示食道癌的淋巴結轉移和臨床分期與hGITRL表達密切相關(均P=0.000)，見表2。

表2食道癌hGITRL蛋白表達與臨床病理參數的關系(n)

項目hGITRL陽性(n=58)hGITRL陰性(n=54)P值性別男36320.761女2222年齡≥6029330.237<602921腫瘤部位上段14150.692中段2519下段1920病理類型鱗癌50520.061腺癌82分化程度高-中34290.600中-低2425淋巴結轉移有4018<0.001無1836臨床分期Ⅰ～Ⅱ期1637<0.001Ⅲ～Ⅳ期4217

2.4hGITRL陽性表達與臨床預后的關系hGITRL陽性表達者的3年無瘤生存期和生存率分別為(30.6±1.3)個月和74.1%，明顯低于hGITRL陰性者的(34.4±0.8)個月和90.7%(P=0.020)；同時，hGITRL陽性者5年無瘤生存期和生存率分別為(46.9±2.6)個月和65.5%，明顯低于hGITRL陰性者的(55.1±1.7)個月和81.5%(P=0.041)，見圖1、圖2；進一步采用Cox生存風險模型分析發現hGITRL蛋白表達與食道癌患者3年無瘤生存密切相關(P=0.029；RR=1.504；95%CI：1.045～2.401)，但未發現與5年無瘤生存明顯相關。見表3，表4。

圖1　 hGITRL陽性者和陰性者的3年無瘤生存曲線比較

影響因素β值Waldχ2值P值RRRR95%CI年齡-0.3850.1820.6270.5390.084～2.886性別0.2800.8160.3661.4230.621～2.428腫瘤部位-0.2811.4550.2180.7580.278～1.292病理類型0.4140.6570.3841.5010.681～3.747分化程度-0.5181.4320.2340.5960.155～1.291淋巴結轉移-0.4553.2690.1721.6350.771～2.234臨床分期0.2730.7160.0860.7230.321～1.928hGITRL-1.4432.7890.0291.5041.045～2.401

表4食道癌患者5年無瘤生存影響因素的Cox分析

影響因素β值Waldχ2值P值RRRR95%CI年齡-0.1850.2510.6260.5310.093～3.204性別-0.3620.3190.5280.8770.313～3.497腫瘤部位-0.9890.5810.4130.4150.176～2.481病理類型-2.8392.3550.1771.2550.478～3.279分化程度0.4380.5570.4120.5010.221～2.747淋巴結轉移-2.1282.4320.1941.2960.535～2.831臨床分期1.8721.0670.1010.9180.150～1.981hGITRL-3.1604.1190.0611.2140.747～2.412

圖2　hGITRL陽性者和陰性者的5年無瘤生存曲線比較

3討論

作為最為常見的惡性腫瘤之一，食道癌發生具有顯著性地域差異，且普遍認為吸煙和酒精過度攝入是鱗癌發生的高危因素，而Barrett食管是腺癌高危因素，兩種病理類型腫瘤均存在較高的等位基因缺失率，約為36%～75%〔6〕。已經發現的與食道癌發生發展相關的基因包括p53、MTS、APC和MCC等〔1〕。由于惡性腫瘤的發生、發展是一個多因素參與的多階段和多基因相互作用的復雜過程，所以除了癌基因和抑癌基因的變異參與外，特異性蛋白在分子水平上的不同調控變化也可能是食道癌發生和發展的重要因素〔1〕。本研究發現hGITRL可高表達于一些腫瘤細胞表面〔3〕。再者，有研究發現GITRL蛋白在結直腸癌患者中有明顯表達增高，提示了GITRL可能與消化道惡性腫瘤的發病相關〔5〕，同時也有報道示GITRL的基因多態性與消化道惡性腫瘤存在相互關系〔4〕。本研究提示了hGITRL蛋白可能在消化道腫瘤發生和發展過程中的重要作用，可作為一個候選癌基因及治療靶點進行深入研究。本研究提示了hGITPRL成為生物學標志物的可能，且我們還發現hGITRL蛋白在食道異常增生患者和正常人中也同時存在顯著性差異，從而可能揭示了hGITRL參與了食道癌早期發生過程，為其成為早期診斷標志物提供了一定理論依據〔7〕，目前已有研究證明在hGITRL發生結構誘變后，其突變型可以影響T細胞的增殖能力〔3〕，但尚待大樣本、多中心臨床研究和基礎研究進一步明確。另外hGITRL可能同時參與了食道癌的惡性進程〔8〕，且目前尚缺乏基礎研究證實這一推論。并且我們在隨訪分析中發現，hGITRL尚可能只能作為食道癌3年無瘤生存的預后預測分子，至于5年無瘤生存和總生存預后尚需進一步研究證實。

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〔2015-05-09修回〕

(編輯袁左鳴)

〔中圖分類號〕R735.1

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1882-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.044

第一作者：李志祥(1978-)，男，碩士，主治醫師，主要從事乳腺甲狀腺腫瘤的研究。