前列腺酸性磷酸酶負載的樹突細胞聯合細胞因子誘導殺傷細胞過繼免疫治療晚期激素難治性前列腺癌的臨床研究

胡　娜　孟凡旭　于鵬躍　劉　念　張　奇　劉林林

(吉林大學第二醫院放療科，吉林　長春　130041)

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前列腺酸性磷酸酶負載的樹突細胞聯合細胞因子誘導殺傷細胞過繼免疫治療晚期激素難治性前列腺癌的臨床研究

胡娜孟凡旭1于鵬躍2劉念3張奇劉林林

(吉林大學第二醫院放療科，吉林長春130041)

〔摘要〕目的探討前列腺酸性磷酸酶(PAP)負載的樹突細胞(DC)聯合細胞因子誘導殺傷細胞(CIK)對晚期激素難治性前列腺癌(HRPC)患者的臨床療效。方法回顧性研究吉林大學第二醫院腫瘤生物治療中心2009年4月至2013年2月收治的32例診斷明確且不再適宜手術或放化療的晚期HRPC患者，隨機分成兩組：對照組16例，接受前列腺癌細胞系裂解物致敏DC聯合CIK過繼免疫；實驗組16例，接受PAP-DC聯合CIK過繼免疫治療，記錄兩組患者的臨床療效。結果兩組患者治療中均未出現嚴重不良反應，晚期HRPC患者對DC聯合CIK治療的耐受良好。兩組患者治療后外周血T淋巴細胞亞群較治療前增高，但并無統計學差異(P>0.05)；兩組治療后1 w血清前列腺特異性抗原(PSA)值有所升高，治療后1個月PSA值下降，且較治療前有統計學差異(P<0.05)，但組間比較無統計學意義(P>0.05)；短期療效評價：實驗組3例部分緩解(PR)、9例疾病穩定(SD)、4例疾病進展(PD)，對照組2例PR、8例SD、6例PD，實驗組的客觀緩解率(ORR)高于對照組(P<0.05)。患者治療后體力狀況(KPS評分)改善，兩組間無統計學差異；兩組總生存期(OS)無統計學意義，而兩組中位疾病進展時間(mTTP)差異顯著(P<0.05)，實驗組無進展生存期(PFS)優于對照組(P<0.05)。結論PAP負載DC聯合CIK過繼免疫治療晚期HRPC患者的臨床療效不劣于前列腺癌細胞裂解物負載的DC-CIK免疫治療，使患者無病生存獲益，具有較好的臨床應用價值。

〔關鍵詞〕前列腺酸性磷酸酶；前列腺癌細胞系裂解物；樹突細胞；細胞因子誘導的殺傷細胞；激素難治性前列腺癌

前列腺癌幾年內幾乎均進展至激素難治性前列腺癌(HRPC)階段〔1〕。近年來，多項研究顯示免疫治療對前列腺癌有較好的療效，其中大多數是基于樹突細胞(DC)疫苗的治療〔2〕。本研究采用特異性前列腺酸性磷酸酶(PAP)致敏的DC細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)過繼免疫治療晚期HRPC患者，與前列腺癌細胞系裂解物致敏DC聯合CIK過繼免疫治療對照，并對其免疫反應性、特異性腫瘤標志物細胞(PSA)、客觀緩解率、生活質量、生存時間和安全性進行回顧性總結，旨在證明此PAP負載DC-CIK過繼免疫治療晚期HRPC患者的臨床療效不劣于前列腺癌細胞裂解物負載的DC-CIK免疫治療。

1材料與方法

1.1研究對象選擇2009年4月至2013年2月在吉林大學第二醫院腫瘤生物治療中心收治的32例晚期HRPC患者，且滿足以下條件：患者卡氏功能狀態評分(KPS)≥60分(預期生存>3個月)；同時患者造血功能及心、肝、腦、腎等重要器官功能正常，排除其他系統和器官惡性腫瘤、自身免疫性疾病。隨機分成兩組，對照組16例，接受前列腺癌細胞系裂解物致敏DC聯合CIK過繼免疫，平均年齡(74.1±10.3)歲，侵襲或轉移鄰近器官4例，盆腔淋巴結1例，骨15例，盆腔外轉移2例，KPS評分(68.75±8.85)分，PSA(54.02±44.47)ng/ml；實驗組16例，接受PAP-DC聯合CIK過繼免疫治療，平均年齡(72.9±12.8)歲，侵襲或轉移鄰近器官3例，盆腔淋巴結2例，骨13例，盆腔外轉移2例，KPS評分(71.25±9.57)分，PSA(53.31±41.47)ng/ml。兩組患者各項指標無統計學意義。DC聯合CIK免疫治療的方法和程序經本院倫理委員會批準，患者及其法定代理人知情并簽署治療同意書。

1.2主要儀器和材料血細胞分離機(德國Kabi Fresenius公司)，FC500流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)，酶聯免疫酶標儀(美國Themro公司)，Ficoll-Hypaque(美國Gibco公司)，RPMI1640(PAA laboratories GmbH Linz Austria)，AIM-V invitrogene培養液，rhGM-CSF、rhIL-4、腫瘤壞死因子(TNF)-α，CD3單抗，內毒素檢測試劑盒。前列腺酸性磷酸酶多肽序列由英國蘇格蘭高地島嶼大學(UHI)設計與合成。

1.3治療方法

1.3.1自身前列腺癌細胞的分離和抗原制備經穿刺活檢獲得對照組患者少量前列腺癌組織，用生理鹽水(含青霉素鈉、鏈霉素各100 U/ml)洗滌，研磨成勻漿，采用淋巴細胞分離液分離后獲得自身癌細胞，加入RPMI1640液后行原代培養與擴增，滿足治療需求后反復凍融，再經超聲波破碎裂解，離心并吸取上清液，經濾膜除菌后作為腫瘤抗原備用，同時行蛋白定量檢測。

1.3.2DC細胞的制備及致敏采用血細胞分離機采集患者外周血單個核細胞，獲取1～3×109個單核細胞及血漿50 ml。經Ficoll-Hypaque分離單個核細胞后，離心洗滌2次，用RPM1640無血清培養液重懸，調整細胞濃度為2×106/ml，將細胞培養瓶置于37℃、5% CO2培養箱培養2 h后獲得貼壁細胞，加入含1 000 U/ml rhGM-CSF、50 ng/ml rhIL-4的無血清AIM-V培養液繼續培養；第3天進行1/3換液，同時補充上訴細胞因子；第5天加入自身癌細胞抗原或PAP多肽(終質量濃度為20 μg/ml)，誘導培養12～16 h，加入TNF-α(500 U/ml)，繼續培養24 h；第8天收集細胞，離心，生理鹽水洗滌3次，用含有10%患者自身血漿的生理鹽水重懸，總體積為100 ml，經靜脈回輸患者。

1.3.3CIK細胞的制備將分離的單核細胞重懸于AIM-V無血清培養基中，調整細胞濃度1×106/L，接種到10 cm的細胞培養皿中，向培養皿中加入γ-干擾素(IFN-γ)(1 000 U/ml)，輕搖混勻后，放入37℃、CO2培養箱培養24 h；次日加入CD3抗體激活殺傷細胞(CD3McAb，50 ng/ml)，IL-2(300 U/ml)，IL-1(100 U/ml)，繼續培養；每隔3 d半量換液1次，同時補充上述因子；第8～9天收集CIK細胞，離心，生理鹽水洗滌3次，用含有10%患者自身血漿的生理鹽水重懸，總體積為100 ml，經靜脈回輸患者。

1.3.4致敏DC聯合CIK的細胞回輸培養7 d，DC和CIK進行內毒素和無菌檢測合格后，于第8～16天(分8～9 d)將致敏DC、CIK輪流回輸患者，致敏DC和CIK每次回輸細胞量分別約為(0.5～1.0)×109與(0.2～1.0)×109。回輸患者前肌肉注射異丙嗪25 mg預防過敏反應，30 min內輸注完畢。輸注細胞過程中密切監測患者(體溫、心率、呼吸和血壓變化)生命體征，隨訪48 h觀察患者的短期不良反應。不良事件依據常見不良反應評價標準(CTCAE)3.0版記錄。

1.4免疫指標分別于治療前與治療后1 w采集兩組患者的外周血，進行熒光標記后采用FC500流式細胞儀行T淋巴細胞亞群的檢測。

1.5療效評估記錄兩組患者治療前后KPS評分分別于治療前、治療后檢測PSA值。所有患者隨訪2年，記錄總生存期(OS)、無進展生存期(PFS)。短期療效評價：治療3個月后行客觀緩解率(ORR)評價，全身骨顯像和盆腔MR等作為評價疾病狀態的指標，療效評價按實體瘤療效評價標準進行。ORR率=完全緩解(CR)+部分緩解(PR)+疾病穩定(SD)/總例數×100%。

1.6統計學方法應用SPSS17.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2結果

2.1治療前后兩組患者外周血T淋巴細胞亞群變化治療后兩組患者的T淋巴細胞亞群有增高趨勢，其中實驗組總T淋巴細胞(CD3+)、對照組T輔助細胞(CD3+/CD4+)較治療前增高幅度較明顯(P<0.05)，但兩組之間無統計學意義(P>0.05)。兩組自然殺傷(NK)T細胞與NK細胞無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1兩組患者治療前后外周血T淋巴細胞亞群表型變化(x±s，n=16)

指標對照組治療前治療后實驗組治療前治療后CD3+(%)53.26±11.2756.99±13.7155.04±12.2859.07±15.881)CD3+/CD4+30.71±11.4636.51±11.551)33.21±10.3138.86±15.88CD3+/CD8+21.01±9.4223.19±9.6117.91±7.4518.91±10.06CD4+/CD8+1.83±0.441.94±0.482.27±0.562.75±0.68NKT細胞(%)3.89±0.964.95±1.223.15±0.763.53±0.84NK細胞(%)19.73±10.8821.21±10.5224.50±13.1121.13±17.34

與治療前比較：1)P<0.05

2.2KPS評分及血清PSA水平治療后對照組和觀察組患者KPS評分〔(78.13±8.34)分，(80.63±7.72)分〕較治療前〔(68.75±8.85)分，(71.25±9.57)分〕改善，兩組間無統計學差異(P>0.05)。兩組患者治療后1 w的PSA值有所升高，治療后1個月的PSA值下降，且較治療前有統計學差異(P<0.05)，但組間比較無統計學意義。見圖1。

2.3不良事件及耐受性評估兩組治療后疲倦乏力、骨痛、食欲不振等癥狀明顯改善。患者輸注細胞過程中，密切監測患者生命體征，同時隨訪48 h觀察患者的短期不良反應，監測及隨訪內容包括變態反應、全身癥狀、肝腎功能、血液系統、心血管系統等。患者出現短暫發熱伴一過性寒戰(≤39.5℃)、皮疹、轉氨酶升高，經退熱、脫敏、保肝降酶等對癥治療后恢復正常；其他患者未出現不良事件。其中對照組發熱、皮疹各1例(6.25%)，肝功異常2例(12.5%)，實驗組發熱2例(12.5%)，皮疹1例(6.25%)。肝功異常3例(18.75%)。

2.4短期療效評價對照組0例CR、2例PR、8例SD、6例疾病進展(PD)，實驗組0例CR、3例PR、9例SD、4例PD，實驗組的ORR(75%)高于對照組(62.6%)。兩組OS無統計學意義(P>0.05)。而實驗組中位疾病進展時間(mTTP)較對照組延長(11.4個月vs 8.1個月)。見圖2。

圖1　兩組PSA水平的變化

圖2　兩組之間對于OS的生存分析

3討論

大多數的腫瘤疫苗是依據其和人類主要組織相容性復合體(MHC)分子的結合力設計的。含有8～10個氨基酸的單一勝肽抗原決定子可以和DC上的第一型(MHCⅠ)結合而引發細胞毒性T細胞(CTL)的反應，而和MHCⅡ結合的多肽類抗原決定子可以活化輔助T細胞，以協助CTL反應和抗體產生。由于活化后的輔助T細胞可以協助活化記憶T細胞，因此和MHCⅡ相關的腫瘤疫苗可以有效地防止癌癥在治療后再復發。

PSA由腺上皮分泌到前列腺導管系統內，其周圍有血-上皮屏障，避免了上皮細胞產生的PSA直接分泌到血液中，從而維持了血液中PSA的低濃度。前列腺癌侵襲性原因破壞了該屏障時，致使PSA直接進入血液內，從而導致血液中PSA的升高。該研究免疫治療后最初的PSA峰值的產生可能是免疫功能增強的原因，這在其他多項研究中也有發現〔3〕。本研究中兩組OS無統計學意義，有可能與隨訪時間較短有關。而兩組之間mTTP存在差異，相較于HRPC患者多西他賽單藥化療的中位進展時間6～7個月〔2，4〕及對照組前列腺癌細胞系裂解物抗原負載DC聯合CIK免疫治療的中位進展時間8.1個月，分別延長了4.4～5.4個月和3.3個月的無病生存期。治療后的短期療效評價提示特異性PAP抗原負載DC聯合CIK免疫治療對病灶的殺滅作用及防止其復發較對照組存在優勢。實驗組MHCⅡ分子專一性結合的PAP多肽，不僅可以活化輔助T細胞、協助CTL的反應和抗體的產生，同時可以協助活化記憶T細胞，可不受限于免疫系統耐受性、又能夠針對多種不同癌細胞進行毒殺攻擊作用，是可以防止癌癥復發的腫瘤疫苗。

此特異性PAP多肽疫苗負載的DC聯合CIK治療是安全的，在體內能激發特異性T細胞應答，與自身癌細胞裂解物無明顯差異；同時可以協助活化記憶T細胞，防止癌癥復發。該疫苗可作為晚期HRPC患者的一種有效姑息性治療，使患者長期帶瘤生存，提高生存質量；其特異性協助活化記憶T細胞功能可以防止腫瘤復發，延長患者無病生存期；對于非晚期患者，可以配合手術、放化療及內分泌治療等傳統治療，在腫瘤負荷降低后進一步清除散在癌細胞，減少復發轉移，緩解毒副反應，提高療效〔5〕。本研究樣本量小，體內分子機制、治療評估方案的優化及樣本數量的擴大等問題還需進一步研究。

4參考文獻

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〔2015-06-17修回〕

(編輯袁左鳴)

〔中圖分類號〕R737.25

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1893-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.049

通訊作者：劉林林(1970-)，女，博士，博士生導師，主任醫師，主要從事腫瘤放射治療、化療及生物治療等研究。

基金項目：吉林省科技廳資助項目(20130413042GH)

1吉林省腫瘤醫院放療科2吉林大學第二醫院檢驗科

3吉林大學第一醫院

第一作者：胡娜(1990-)，女，在讀碩士，主要從事腫瘤放射治療的研究。