嗎啡與gp120致大鼠學習記憶障礙的作用及機制*

陳桂玲，　龔　正，　劉思思，　江明亮，　潘　銳，　行妍妍，　林麗清，　董　軍△

( 暨南大學 1醫學院病理生理學系, 2國家中醫藥管理局病理生理學實驗室, 3粵港澳中樞神經再生研究院,4附屬第一醫院骨科, 廣東 廣州 510632)

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嗎啡與gp120致大鼠學習記憶障礙的作用及機制*

陳桂玲1,2,3▲，龔正1,2,3▲，劉思思1,2,3，江明亮1,2,3，潘銳4，行妍妍1,2,3，林麗清1,2,3，董軍1,2,3△

( 暨南大學1醫學院病理生理學系,2國家中醫藥管理局病理生理學實驗室,3粵港澳中樞神經再生研究院,4附屬第一醫院骨科, 廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 探討嗎啡與gp120致大鼠學習記憶障礙的作用與機制。方法: 4～6周的SD大鼠，側腦室注射嗎啡與gp120 V3環，Morris水迷宮評價空間記憶能力。TUNEL染色觀察大鼠海馬組織的陽性凋亡細胞數。Western blot法檢測p-ERK的表達情況。結果: 與對照組相比，100 μg/kg嗎啡組、200 μg/kg嗎啡組以及gp120 V3環組均能使大鼠的逃避潛伏期延長(P<0.05)，目標象限停留時間以及穿越目標象限次數減少(P<0.05)，海馬區陽性細胞數增多(P<0.01)，海馬區p-ERK的表達增多(P<0.01)；200 μg/kg嗎啡+gp120 V3環組與200 μg/kg嗎啡組或gp120 V3環組相比，逃避潛伏期延長(P<0.05)，目標象限停留時間以及穿越目標象限次數減少(P<0.05)，海馬區陽性細胞數增多(P<0.01)，海馬區p-ERK的表達增多(P<0.01)。結論: 側腦室注射gp120 V3環可致大鼠學習與記憶障礙，嗎啡能增強其效應，機制可能與增強海馬區p-ERK的表達有關。

[關鍵詞]HIV相關神經認知障礙； 嗎啡； HIV-1 gp120 V3環； 海馬神經元； 細胞凋亡

艾滋病是當今人類最具災難性的流行病之一。截至2013年底，全球感染人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)人數已超過3 500萬[1]。HIV-1病毒感染不僅對外周免疫系統造成損傷，在很大程度上對神經認知功能的喪失也有影響。盡管高效抗逆轉錄療法(highly active antiretroviral therapy, HAART)的應用有效降低了艾滋病患者的死亡率，但由于其在血腦屏障中的滲透性差[2]，生物利用度低，因此HIV相關神經認知障礙(HIV-associated neurocognitive disorders,HAND)的患者明顯增多。流行病學數據顯示，大約有50%的HIV-1陽性患者伴隨著神經認知功能障礙的發生。

大量研究證明，毒品濫用者更容易感染HIV，更有可能遭受神經功能異常和其它機會性感染[3]。嗎啡是全球最流行的毒品海洛因的腦內代謝物，腦室內濃度極高[4]。然而，嗎啡與HIV聯用致神經系統損傷的機制尚未闡明。

本實驗擬通過側腦室注射嗎啡與HIV-1 gp120 V3環(以下簡稱gp120 V3環)，觀察大鼠的行為學以及海馬神經元形態的改變，旨在探討gp120 V3環與嗎啡聯用致大鼠學習記憶障礙的作用及其機制。

材料和方法

1動物

200只SD大鼠，雌雄各半，4～6周齡，體重120～160 g，購自廣東省實驗動物中心[合格證號: SCXK(粵)2008-0002，粵監證字：2008A015]。實驗第一部分分為對照組、假手術組、10 μg/kg嗎啡組、100 μg/kg 嗎啡組和 200 μg/kg 嗎啡組；第二部分分為對照組、假手術組、gp120 V3環組、嗎啡組和gp120 V3環+嗎啡組。每部分大鼠各100只，隨機分為5組(每組20只)，實驗程序通過暨南大學實驗動物倫理委員會嚴格審查。

2主要試劑

gp120 V3環購自Raybiotech；嗎啡購自沈陽第一制藥廠；人工腦脊液配方(mmol/L)：124.0 NaCl，3.0 KCl，2.0 CaCl2，2.0 MgCl2，1.25 NaH2PO4，26.0 NaHCO3，10.0 glucose。

3主要方法

3.1 立體定位手術與側腦室注射腹腔注射40 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉大鼠，并將其固定于立體定位儀上。在前囟向后1.0 mm，中線左或右旁開1.5 mm處放置一根聚乙烯塑料管，植入顱骨下4.0 mm處，用502膠及牙托粉充分固定。術后4只大鼠因手術意外被剔出實驗。 62.5萬 U/kg青霉素鈉肌肉注射3 d。手術恢復4～5 d后，開始側腦室注射給藥。給藥過程中固定大鼠，自腦表皮垂直將微量進樣器針深入塑料管3.5～4.0 mm，假手術組給予人工腦脊液 5 μL，gp120 V3環組大鼠給予50 ng/d(5 μL) 劑量藥物，嗎啡組給予低(10 μg/kg)、中(100 μg/kg)、高(200 μg/kg)劑量，gp120 V3環+嗎啡組給予gp120 V3環(50 ng/d)和200 μg/kg嗎啡(gp120 V3環與嗎啡均溶于5 μL 人工腦脊液)，均注入側腦室，留針5 min，給藥速度為1 μL/min，以保證溶液充分彌散，然后緩慢撤針。連續給藥3 d，每天1次，均為上午10時左右給藥，第4天行水迷宮測試。對照組未經任何手術處理。嗎啡劑量參考文獻執行[5-6]。

3.2Morris水迷宮實驗定位航行實驗(place navigation)測量大鼠學習記憶的能力：實驗歷時5 d，第1 天讓大鼠自由游泳2 min，然后選擇N象限中點為第1入水點，將大鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺所需時間 (逃避潛伏期)。隨后按照北(north，N)-東(east，E)-南(south，S)-西(west，W)的順序將訓練大鼠逐一放入水池，訓練第2天將E象限中點作為第一入水點，按照E-S-W-N順序逐一將大鼠放入水池中，第3天將S象限中點作為第一入水點，按照S-W-N-E順序逐一將大鼠放入水池，第4、5天依次類推。訓練過程中，如果大鼠在60 s內未找到平臺，需將其引至平臺休息30 s，這時潛伏期記錄為60 s。 空間搜索實驗(spatial probe test)測量大鼠學會尋找平臺后，對平臺空間位置記憶能力：選用目標象限(平臺所在象限)的逗留時間和穿越目標象限的次數作為測試參數。定位航行實驗結束后撤除平臺，然后在S象限的同一入水點將大鼠面向池壁放入水中，利用檢測跟蹤系統對其游泳過程進行監控，記錄其在60 s內的游行軌跡。

3.3原位末端標記法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)染色冰凍切片的TUNEL染色按說明書步驟進行。首先，切片用4%多聚甲醛固定10 min，用PBS沖洗2 次；然后，加TUNEL反應液37 ℃避光孵育1 h。陰性對照組未加入TdT。接著加TdT終止緩沖液終止反應，PBS沖洗2 次。最后放入熒光素標記的抗鼠抗體中孵育。每只動物取5張切片并進行陽性細胞計數。

3.4Western blot實驗取100 mg大鼠海馬組織，提取各組蛋白，BCA法蛋白定量。定量后的蛋白與5×上樣緩沖液混勻后煮沸變性，約5～10 min。使用8%或者15%的SDS-PAGE分離蛋白，再轉移到PVDF膜上，轉膜條件15～30 V，時間20～40 min。BSA室溫封閉1 h，I 抗4 ℃孵育過夜，II 抗室溫孵育1 h，DAB顯色，灰度掃描做定量分析。

4統計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行數據分析，結果數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，各組間比較行單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組方差齊時，組間兩兩比較采用SNK法，各組方差不齊時，采用Tamhane’s T2法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1不同劑量嗎啡對大鼠定位航行實驗及空間探索實驗的影響

日間對比發現，組間大鼠的自發活動沒有差異(數據未顯示)，期間引導大鼠進行行為學實驗。到第2～5天，在一個隱藏平臺的水迷宮受訓實驗中，嗎啡100 μg/kg組和200 μg/kg組大鼠的逃避潛伏期延長，出現學習障礙。空間探索實驗中，大鼠受訓24 h后，嗎啡 100 μg/kg組和200 μg/kg組大鼠的穿越目標象限的次數與停留時間減少，差異有統計學顯著性(P<0.05)；但是嗎啡10 μg/kg組與對照組相比差異不大。提示嗎啡能降低空間學習能力,見圖1A～C。

Figure 1.Rat showed impaired spatial learning and recognition after treated with morphine and/or gp120 V3 loop. A: the latency to escape the hidden platform in the rats treated with morphine at different doses; B: probe tests for frequency of crossing target quadrant in the rats treated with morphine at different doses; C: probe tests for retention time in target quadrant in the rats treated with morphine at different doses; D: the latency to escape the hidden platform in the rats treated with morphine and/or gp120 V3 loop; E: probe tests for frequency of crossing target quadrant in the rats treated with morphine and/or gp120 V3 loop; F: probe tests for retention time in target quadrant in the rats treated with morphine and/or gp120 V3 loop.Mean±SEM. n=20.*P<0.05 vs control group;##P<0.05vsgp120 V3 loop group or 200 μg/kg morphine group.

圖1嗎啡和gp120 V3環使大鼠學習與認知能力減弱

2嗎啡與gp120 V3環致大鼠空間以及學習記憶障礙的改變

為了模擬濫用藥物的HAND患者的學習以及空間記憶障礙，我們采用了嗎啡的最大容許劑量(200 μg/kg)來進行第二部分的實驗。結果顯示，gp120 V3環組大鼠的逃避潛伏期延長，穿越目標象限與停留時間減少，出現學習以及空間記憶障礙，gp120 V3 環+ 200 μg/kg 嗎啡組與嗎啡或gp120 V3 環單獨組相比逃避潛伏期更長，停留目標象限時間更短，差異有統計學顯著性(P<0.05)，見圖1D～F。

3嗎啡與gp120 V3環誘導的大鼠海馬組織形態學的改變

由圖2可看出，海馬組織中，嗎啡組與gp120 V3環組TUNEL陽性細胞數高于對照組(P<0.01)，嗎啡+gp120 V3環組TUNEL陽性細胞數比嗎啡或gp120 V3環單獨組高(P<0.01)，提示嗎啡能增強gp120 V3環的誘導海馬神經元凋亡的毒性。

4嗎啡和gp120 V3環誘導大鼠海馬組織的細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERK)的磷酸化

嗎啡組和gp120 V3 環組的 p-ERK 蛋白水平較對照組增高，與對照組相比差異有統計學顯著性(P<0.01)，嗎啡+gp120 V3 環組的p-ERK 蛋白水平比嗎啡或gp120 V3環單獨組增高，差異有統計學顯著性(P<0.01)，表明嗎啡和gp120 V3環激活了 ERK 信號通路。嗎啡與 gp120 V3環聯用對 ERK激活作用強于單用，見圖3。

討論

在HAART廣泛應用以前，HAND的平均患病率為55%。其最嚴重形式HIV相關癡呆癥(HIV-associated dementia,HAD)的患病率為20%～30%，每年發病率為7%[7]。另外，HAD/HAND的發病率和嚴重性的上升和加重與濫用可卡因、大麻以及麻黃堿[8]密切相關。

吸食嗎啡一直以來都是一個嚴重社會衛生問題。嗎啡是一種阿片樣肽，前期報導稱內源性的多肽類物質能影響中樞神經系統的發育[9]，通過促進神經元的存活、影響神經元以及膠質細胞的增殖、神經元的遷移、樹突的生長以及脊髓的形成[10]。離體神經元培養中，低劑量的嗎啡對血清剝奪以及十字孢堿產生的神經毒素具有保護性，長期應用低劑量的嗎啡可能利于細胞的存活[11]。然而Turchan-Cho-lewo等[12]發現HIV感染者合并鴉片濫用以及ApoE4等位突變能增加患癡呆的風險。原代海馬神經元體外實驗表明，高濃度的嗎啡有更強的神經毒性[13]，因為嗎啡能殺死高度敏感的神經元件[14]。

Figure 2.TUNEL positive cells in the hippocampal zone of the rats treated with morphine and/or gp120 V3 loop. The scale bar=100 μm. Mean±SEM. n=10.**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs gp120 V3 loop group or 200 μg/kg morphine group.

圖2大鼠海馬區域的TUNEL陽性細胞數的比較

gp120是HIV中最高效的神經毒性成分之一。在大腦組織中，HIV能在感染的巨噬細胞/小膠質細胞中增殖并釋放HIV蛋白如gp120、Tat等，這些蛋白可與多巴胺轉運體結合并削弱其功能，引起神經元損傷，從而參與HAND的發病機制。另外，有研究證實，gp120 轉基因鼠可造成神經元的缺失以及樹突的減少[15]。

Figure 3.Morphine and/or gp120 V3 loop induced phosphorylation of ERK in the hippocampus determined by Western blot analysis. Mean±SEM. n=10.**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs gp120 V3 loop group or 200 μg/kg morphine group.

圖3海馬區嗎啡與gp120 V3環誘導ERK的磷酸化

對艾滋病患者而言，長期高劑量濫用毒品，其大腦以及脊髓中的嗎啡濃度較高[4]。因此我們采用側腦室注射嗎啡(200 μg/kg)建立毒品濫用的大鼠模型，觀察長期大劑量使用嗎啡能否造成神經元的損傷。結果表明中劑量嗎啡(100 μg/kg)以及高劑量嗎啡(200 μg/kg)連續注射3 d能降低大鼠的學習以及記憶能力。但低劑量嗎啡(10 μg/kg)對大鼠的學習以及記憶能力沒有影響。在本實驗中，我們發現側腦室注射gp120 V3環可導致大鼠學習及記憶障礙，海馬神經元凋亡增多。而gp120 V3 環+嗎啡組與嗎啡或gp120 V3 環單獨組相比逃避潛伏期更長，停留目標象限時間更短。

ERK是一個重要的凋亡通路蛋白，它的激活可調控細胞的增殖和凋亡、凋亡相關蛋白Bax的表達以及線粒體膜去極化，阻斷ERK會抑制線粒體細胞色素C的釋放和caspase-3的活化[16]。另外，在大鼠缺血再灌注的脊髓模型中，抑制MEK/ERK通路能減少小膠質細胞的活化以及IL-1β的表達，提示此通路在防治神經相關疾病中的作用不容忽視[17]。還有研究顯示，急性和亞慢性嗎啡處理組動物的多巴胺能邊緣系統p-ERK的水平升高[18]。本實驗通過檢測嗎啡組、gp120 V3環組和gp120 V3環+嗎啡組大鼠海馬區的p-ERK蛋白水平，發現ERK蛋白過度激活并誘導神經元的凋亡，提示嗎啡與gp120 V3環可能通過ERK通路引起神經元的凋亡。

因此，本實驗側腦室注射gp120 V3環可致大鼠學習與記憶障礙，嗎啡能增強其效應，其機制可能是通過增強海馬區p-ERK的表達來實現。這一結果為HIV感染合并毒品濫用致HAND的防治提供了新靶點。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

TGF-β上調胰腺導管腺癌微管相關蛋白MAP1S的表達和自噬流

自噬是細胞重復利用錯誤折疊/聚集的蛋白質或功能失調的細胞器(如受損的線粒體)的自我調節過程。作為神經元細胞特有的MAP1A和MAP1B的同源物，微管相關蛋白MAP1S(最初被稱為C19ORF5)廣泛分布于機體內，最初曾與自噬的標志物微管相關蛋白1輕鏈3(light chain 3, LC3)一起被分離。MAP1S通過LC3把自噬小體與微管和線粒體連接起來，從而可以調節自噬過程中自噬前體的形成和降解。在小鼠肝癌模型和膀胱癌患者，MAP1S誘導的自噬均可抑制腫瘤的發生。轉化生長因子β(transforming growth factor β, TGF-β)信號通路在胰腺癌的發生發展過程中處于重要地位，并且高表達TGF-β具有抑制腫瘤的作用，還可改善胰腺導管腺癌切除術患者的預后。為了了解胰腺導管腺癌中TGF-β和MAP1S誘導的自噬之間的關系，一個由中美科學家組成的研究小組隨機挑選了33位胰腺導管腺癌患者，收集他們的腫瘤組織和癌旁正常組織，檢測其TGF-β與自噬標志物MAP1S和LC3的關系，并在體外培養的胰腺癌細胞系中檢測TGF-β和自噬標志物的變化的原因和結果。研究結果發現胰腺導管腺癌患者的腫瘤組織中，TGF-β與自噬標志物MAP1S和LC3的表達水平顯著升高。TGF-β促使MAP1S蛋白表達增加，并使自噬流增強。以上結果提示TGF-β可增強MAP1S對自噬的誘導作用，從而抑制胰腺導管腺癌的進展。

PLoS One, 2015, 10(11):e0143150(周晗)

Role of morphine and gp120 V3 loop in learning and memory dysfunction in rats

CHEN Gui-ling1, 2, 3, GONG Zheng1, 2, 3, LIU Si-si1, 2, 3, JIANG Ming-liang1, 2, 3, PAN Rui4, XING Yan-yan1, 2, 3, LIN Li-qing1, 2, 3, DONG Jun1, 2, 3

(1DepartmentofPathophysiology，2LaboratoryofPathophysiology,StateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,SchoolofMedicine,3GHMInstituteofCNSRegeneration,4DepartmentofOrthopaedics,TheFirstAffiliatedHospital,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:dongjunbox@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To explore the role of morphine and gp120 V3 loop in learning and memory dysfunction in rats. METHODS: SD rats (4～6 weeks old) were infused by the intracerebroventricular injection with gp120 V3 loop and morphine. The Morris water maze was used to evaluate spatial memory. The apoptotic cells in the hippocampal zone were observed by TUNEL staining. The protein level of p-ERK was determined by Western blot. RESULTS: Compared with control group, the rats exhibited a longer latency to escape the hidden platform, shorter retention and less frequency of crossing target quadrant in 100 μg/kg morphine group, 200 μg/kg morphine group and gp120 V3 loop group. The TUNEL positive cells in the hippocampal zone of the rats in 100 μg/kg morphine group, 200 μg/kg morphine group and gp120 V3 loop group were increased. The levels of p-ERK were also increased in 100 μg/kg morphine group, 200 μg/kg morphine group and gp120V3 loop group as compared with the controls. The same results were observed in 200 μg/kg morphine + gp120 V3 loop group as compared with 200 μg/kg morphine group or gp120 V3 loop group. CONCLUSION: Intracerebroventricular injection of gp120 V3 loop induces learning and memory dysfunction in SD rats, and morphine enhances this effect. The mechanism may be related to the combined effect on the increase in p-ERK by gp120 V3 loop and morphine.

[KEY WORDS]HIV-associated neurocognitive disorders; Morphine; HIV-1 gp120 V3 loop; Hippocampal neurons; Apoptosis

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0825- 06

[收稿日期]2016- 02- 08[修回日期] 2016- 04- 22

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81171134； No. 81471235)；廣東省自然科學基金資助項目(No. 2014A030313360)；廣東省科技計劃(No.2010B030700016)；廣州市科技計劃(No. 2010Y1-C291); 高等學校學科創新引智計劃(No. B14036)

通訊作者△Tel： 020-85228289； E-mail： dongjunbox@163.com

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.009

雜志網址： http://www.cjpp.net

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