T0901317通過上調LXRα表達促進人乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡*

涂　劍，　陸凱強，　丁維珂，　劉曉旺，　熊　婷，　劉　伶，　嚴　欣，　周志剛

(南華大學 1藥物藥理研究所， 2第一附屬醫院，湖南 衡陽 421001)

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T0901317通過上調LXRα表達促進人乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡*

涂劍1，陸凱強1，丁維珂1，劉曉旺1，熊婷1，劉伶1，嚴欣1，周志剛2△

(南華大學1藥物藥理研究所，2第一附屬醫院，湖南 衡陽 421001)

[摘要]目的： 觀察肝X受體(LXR)激動劑T0901317對人乳腺癌細胞MDA-MB-231凋亡的作用及其機制。方法: 不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)T0901317處理人乳腺癌MDA-MB-231細胞不同時間(0、12、24、48 h)，用Hoechst 33342染色及流式Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡；Western blot進一步檢測細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、cleaved caspase-3和LXRα的表達，RT-qPCR檢測Bcl-2和LXRα的mRNA表達。結果: 隨著T0901317處理濃度的增加和時間的延長，凋亡現象逐漸明顯。進一步通過Western blot檢測發現，T0901317可下調Bcl-2 蛋白表達，cleaved caspase-3表達增多，而LXRα的表達上調；RT-qPCR檢測結果也顯示，T0901317可下調Bcl-2 mRNA表達，而上調LXRα表達。結論: T0901317能上調LXRα表達，從而促進MDA-MB-231細胞凋亡。

[關鍵詞]T0901317； 肝X受體α； MDA-MB-231細胞； 細胞凋亡

近年有研究指出，肝X受體(liver X receptor, LXR)激動劑T0901317可抑制多種腫瘤包括乳腺癌細胞的增殖[1-4]。另有文獻提出，T0901317還能誘導前列腺癌和黑色素瘤細胞凋亡[5-6]。那么，T0901317對乳腺癌細胞凋亡的作用和機制如何？雖有文獻提示[7]，迄今未見具體報道。本研究主要圍繞T0901317對人乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的影響展開。

材料和方法

1材料

MDA-MB-231細胞購自中科院上海生命科學研究院細胞資源中心；T0901317為Cayman產品；Hoechst 33342和β-actin的 I抗購自Sigma；Annexin V-FITC/PI試劑盒來自Becton-Dickinson；LXRα的 I 抗(Epitomics)；Bcl-2、caspase-3和cleaved caspase-3的 I抗(CST)； II 抗均購自聯科生物公司；TRIzol購自Invitrogen；cDNA逆轉錄試劑盒購自Thermo；LXRα、Bcl-2和β-actin引物由上海生工合成。

2方法

2.1Hoechst 33342染色檢測細胞凋亡濃度分別為0、10、20和40 μmol/L的T0901317處理細胞24 h，4%多聚甲醛固定。Hoechst 33342染色液室溫下避光孵育，封片后用熒光顯微鏡觀察、拍照。

2.2流式細胞術Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡分別加入濃度為0、10、20和40 μmol/L的T0901317處理MDA-MB-231細胞不同時間(0、12、24、48 h)，PBS清洗、回收至相應流式管內。加入不含EDTA的0.25%的外用胰酶消化，吹打后的懸液吸入對應的流式管中，稍混勻。1 800 r/min離心3 min，預冷PBS重懸細胞，重復2次。1 500 r/min離心5 min，棄上清，每管加入195 μL Annexin V-FITC buffer輕重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染液輕柔混勻。室溫避光孵育20 min，冰浴后迅速使用流式細胞儀檢測樣品，Annexin V-FITC激發綠色熒光而PI則激發紅色熒光。

2.3Western blot法檢測細胞中LXRα、Bcl-2、caspase-3和cleaved caspase-3的蛋白水平收集各組細胞，蛋白定量后加入適量5×上樣緩沖液，沸水煮10 min，積層膠80 V、分離膠120 V電泳后濕轉至PVDF膜。室溫封閉約2 h，分別加入 I 抗4 ℃過夜，TBST洗滌3次；再加入 II 抗，37 ℃孵育0.5 h，TBST洗滌4次；用Western blot熒光檢測試劑盒顯影，以內參為對照，掃描結果進行半定量分析。

2.4RT-qPCR檢測LXRα和Bcl-2的mRNA含量按照試劑盒說明書采用TRIzol溶液提取各組細胞總RNA，按逆轉錄試劑盒程序得到相應的cDNA。LXRα的上游引物序列為5’-TCTGGAGACATCTCGGAGGTACAAC-3’，下游引物序列為5’-AGCAAGGCAAACTCGGCATC-3’；Bcl-2上游引物序列為5’-CTGCACCTGACGCCCTTCACC-3’，下游引物序列為5’-CACATGACCCCACCGAACTCAAAGA-3’。加cDNA 0.1 μL，相應基因上、下游引物各1 μL，用無酶水補齊至20 μL，使用95 ℃30 s;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個循環，進行qPCR擴增。根據Ct值，使用2-ΔΔCt法統計結果。

3統計學處理

實驗所得數據采用均數±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0進行統計處理，組間比較采用單因素方差分析及t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1T0901317對MDA-MB-231細胞凋亡的影響

與control組比較，隨著T0901317處理濃度的增加，細胞核發生固縮，核膜溶解，細胞核明顯縮小甚至碎裂，形態呈不規則狀，熒光不均且強度變大，部分細胞可觀察到凋亡小體，尤以20 μmol/L和40 μmol/L的T0901317處理細胞組更為明顯，見圖1A。

流式結果顯示，T0901317處理MDA-MB-231細胞 12 h后，與control組相比，20 μmol/L以及40 μmol/L組出現了凋亡，而處理24 h以及48 h發現20 μmol/L以及40 μmol/L組的凋亡更明顯，活細胞總數下降,見圖1B。上述結果提示，T0901317可隨濃度的增加和時間的推移明顯誘導MDA-MB-231細胞凋亡。

Figure 1.The effect of T0901317 on the apoptosis of MDA-MB-231 cells. A: Hoechst 33342 staining (×200); B: Annexin V/propidium iodide staining and flow cytometry.

圖1T0901317對MDA-MB-231細胞凋亡的影響

2T0901317對MDA-MB-231細胞中凋亡相關蛋白和LXRα蛋白水平的影響

Western blot結果顯示，隨著T0901317處理濃度的增加，與0 μmol/L組相比，LXRα蛋白表達逐漸增強，Bcl-2蛋白表達逐漸減弱，cleaved caspase-3蛋白量增加明顯，差異具有統計學顯著性(P<0.05)。隨著T0901317處理時間的延長，與0 h組相比，LXRα蛋白表達逐漸增強，Bcl-2蛋白表達下降，但是cleaved caspase-3的蛋白量明顯增加，差異有統計學顯著性(P<0.05),見圖2。以上結果說明隨著T0901317孵育濃度的增加和時間的延長，可明顯促進MDA-MB-231細胞凋亡。

Figure 2.The effect of T0901317 on the protein levels of LXRα and apoptosis-related proteins， such as Bcl-2 and cleaved caspase-3， in MDA-MB-231 cells detected by Western blot. Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P< 0.01 vs 0 μmol/L or 0 h.

圖2T0901317對MDA-MB-231細胞中LXRα和凋亡相關蛋白Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

3T0901317對MDA-MB-231細胞中LXRα和Bcl-2 mRNA表達的影響

RT-qPCR結果顯示，與control組相比，隨著T0901317處理濃度的增加，LXRα 的mRNA水平明顯增高，Bcl-2的 mRNA表達明顯降低。與0 h組相比，隨著T0901317處理時間的延長，LXRα的mRNA水平明顯增高，Bcl-2的mRNA表達明顯降低，差異具有統計學顯著性(P<0.05)，見圖3。這說明T0901317能上調LXRα的mRNA水平，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA表達。

Figure 3.The effect of T0901317 on the mRNA expression of LXRα and Bcl-2 in MDA-MB-231 cells detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs 0 μmol/L or 0 h.

圖3T0901317對MDA-MB-231細胞中LXRα和Bcl-2 mRNA表達的影響

討論

乳腺癌的發病機理至今仍未闡明，誘導乳腺癌細胞凋亡可作為生物治療的一種有效手段[7-9]。而T0901317能否誘導乳腺癌細胞凋亡，成為乳腺癌防治的新藥？El Roz 等[7]2012年報道，MCF-7細胞中激動LXR可促進細胞內膽固醇流出，抑制細胞增殖，略有提示檢測了其間細胞凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2的基因表達。據此，我們圍繞T0901317對乳腺癌細胞凋亡的影響做了系統的檢測。

不僅MCF-7細胞，針對MDA-MB-231細胞，我們運用Hoechst 33342染色和流式Annexin V-FITC/PI雙染法檢測，結果均發現隨著T0901317處理濃度的增加，活細胞總數下降，細胞核發生固縮甚至碎裂，熒光不均且強度變大，可觀察到凋亡小體。

半胱天冬酶(caspase)在正常細胞處于非活化的酶原狀態；被活化后，可經凋亡蛋白酶的層疊級聯反應，發生不可逆的凋亡[10]。Caspase-3在caspase家族中是數條細胞凋亡信號通路的下游聚點，一般為最后決定其細胞死亡的關鍵蛋白激酶，可作為凋亡發生的觀察指標之一[11-12]。而Bcl-2蛋白屬于 Bcl-2 蛋白家族抗凋亡蛋白[13]。我們的檢測結果顯示，Bcl-2蛋白表達下降，caspase-3蛋白的表達量不變或略為增加，cleaved caspase-3蛋白量明顯增加，說明caspase-3被激活。進一步提示T0901317隨孵育細胞濃度的增加和時間的延長，明顯促進乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡。

凋亡過程受到多種細胞內外因素的調節，其中NF-κB通路在炎癥、細胞增殖及凋亡等過程中均發揮著重要的調控作用[14-15]。有研究表明，NF-κB可以調控多種與凋亡相關的基因轉錄，抑制細胞凋亡[16]。且NF-κB抑制細胞凋亡主要是上調擁有相應結合位點的抗凋亡基因(如Bcl-2)的表達[17]。T0901317是肝X受體人工合成激動劑，尤其對LXRα具有高親和力。我們的實驗結果也證實，T0901317上調了LXRα的mRNA和蛋白表達。我們另有結果發現，T0901317可下調乳腺癌細胞中NF-κB p65的表達[18]，而生物信息學分析提示，人LXRα序列含有NF-κB的結合位點[19]。這是否提示T0901317促使乳腺癌細胞凋亡的機制可能通過LXRα/NF-κB p65/Bcl-2途徑。接下來我們將進一步通過激動劑和阻斷劑的應用探討T0901317誘導乳腺癌細胞凋亡的可能機制。

綜上所述，我們認為T0901317能上調LXRα的表達，誘導MDA-MB-231細胞凋亡。

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

T0901317 induces apoptosis of human breast cancer MDA-MB-231 cells by up-regulating LXRα expression

TU Jian1, LU Kai-qiang1, DING Wei-ke1, LIU Xiao-wang1, XIONG Ting1, LIU Ling1, YAN Xin1, ZHOU Zhi-gang2

(1Institute of Pharmacy and Pharmacology，2The First Affiliated Hospital, University of South China, Hengyang 421001, China. E-mail: zhouzhigang0734@sina.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the pro-apoptotic effect of T0901317, an artificial agonist of liver X receptor α (LXRα), on human breast cancer MDA-MB-231 cells and its mechanism. METHODS: MDA-MB-231 cells were treated with different concentrations (0, 10, 20 and 40 μmol/L) of T0901317 for different time (0, 12, 24 and 48 h). The cell apoptosis was determined by Annexin V/propidium iodide staining and Hoechst 33342 staining. The expression of apoptosis-related proteins, such as Bcl-2, caspase 3 and cleaved caspase-3, and LXRα was determined by Western blot. The mRNA expression of Bcl-2 and LXRα was analyzed by RT-qPCR. RESULTS: T0901317 induced the cell apoptosis in a dose-and time- dependent manner. The expression of cleaved caspase-3 and LXRα was up-regulated, but Bcl-2 was down-regulated by T0901317. The mRNA expression of Bcl-2 was down-regulated, while LXRα was up-regulated by T0901317.CONCLUSION: T0901317 up-regulates LXRα expression and induces the apoptosis of MDA-MB-231 cells.

[KEY WORDS]T0901317; Liver X receptor α; MDA-MB-231 cells; Apoptosis

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0836- 05

[收稿日期]2015- 12- 21[修回日期] 2016- 02- 23

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81541163); 湖南省自然科學基金資助項目(No. 2015JJ3101); 湖南省教育廳創新平臺項目(No. 15K111);“湖南省分子靶標新藥研究協同創新中心”培育項目(No. 2014-405)

[中圖分類號]R730.23

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.011

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