miRNA-7介導Bax和Bcl-2表達對人鼻咽癌CNE-1細胞凋亡的影響*

孫棟勛，　黃棟棟，　金巧智，　陳武兵，　蔡志毅△

(1嘉興市第一醫院，浙江 嘉興 314000； 2臺州市立醫院耳鼻咽喉科，浙江 臺州 318000)

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miRNA-7介導Bax和Bcl-2表達對人鼻咽癌CNE-1細胞凋亡的影響*

孫棟勛1，黃棟棟1，金巧智2，陳武兵2，蔡志毅2△

(1嘉興市第一醫院，浙江 嘉興 314000；2臺州市立醫院耳鼻咽喉科，浙江 臺州 318000)

[摘要]目的： 研究過表達微小RNA-7(microRNA-7，miRNA-7)誘導人鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)CNE-1細胞凋亡及其與Bax和Bcl-2表達之間的關聯情況。方法: 體外利用脂質體Lipofectamine 2000將miRNA-7模擬物轉染到人鼻咽癌CNE-1細胞中；采用real-time PCR法檢測轉染后各實驗組細胞中miRNA-7的相對表達情況；CCK-8法檢測各組細胞活力的改變；在熒光顯微鏡下利用Hoechst 33258熒光染色法觀察轉染后細胞的凋亡；real-time PCR法檢測Bax和Bcl-2的mRNA表達水平；Western blot法檢測Bax和Bcl-2蛋白表達水平。結果: Real-time PCR結果表明，轉染miRNA-7模擬物的CNE-1細胞中其miRNA-7的相對表達水平明顯高于無關序列組和空白對照組(P<0.01)；轉染miRNA-7模擬物后，CNE-1細胞的活力明顯下降(P<0.01)；Hoechst 33258染色檢測可發現典型的凋亡細胞核形態學變化；real-time PCR及Western blot結果顯示，轉染miRNA-7模擬物的CNE-1細胞中Bax的mRNA及蛋白顯著上調(P<0.01)，而Bcl-2的mRNA及蛋白則顯著下調(P<0.01)。結論: 過表達miRNA-7可以通過調節Bax/Bcl-2之間的比例關系來抑制鼻咽癌CNE-1細胞的惡性生長，并促進細胞凋亡。

[關鍵詞]微小RNA-7； Bax； Bcl-2； 鼻咽癌； 細胞凋亡

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)為我國南方高發的一種頭頸部惡性腫瘤，現已知NPC不僅與化學致癌物及EB病毒等因素有關，且是一種多基因多階段侵襲性疾病，有一定的遺傳傾向，這可能和鼻咽癌中癌基因的激活與抑癌基因的失活所引起的細胞抗凋亡有關。

微小RNA(microRNA，miRNA)是新近發現的又一類高度保守的非編碼小RNA分子，其在基因轉錄后的表達調控方面起著至關重要的作用[1]。miRNA主要介導與靶基因mRNA的3’-非翻譯區(3’-untranslated region，3’-UTR)的完全或不完全配對來導致靶基因mRNA的降解或翻譯抑制來調控細胞增殖、凋亡及分化等生物學行為，進而發揮類似癌基因或抑癌基因的作用[2]。近年來研究發現，miRNA的異常表達與鼻咽癌的發生發展密切相關，如miRNA-17-92和miRNA-155在鼻咽癌中明顯的高表達，而miRNA-143和miRNA-145則表達下調[3]。但是關于鼻咽癌中miRNA的研究仍主要集中在鼻咽癌內以及EB病毒自身合成miRNA表達譜的建立，而對于鼻咽癌中miRNA精細調控的研究仍處于初級階段，鼻咽癌組織中異常表達miRNA的確切調控機制以及miRNA與鼻咽癌組織中靶基因特異性結合位點和機制都有待進一步的深入研究。

miRNA-7是近期發現的在某些腫瘤中具有抑癌作用的微小RNA，這些腫瘤包括胃癌[4]、乳腺癌[5]和肝癌[6]等。本課題組既往研究發現，miRNA-7在體外可以顯著抑制低分化鼻咽癌5-8F細胞的惡性增殖活動[7]，本研究擬通過miRNA基因轉染技術來打破凋亡相關基因Bax/Bcl-2之間的平衡關系，借以探討miRNA-7在體外對人鼻咽癌CNE-1細胞抗凋亡作用的相關影響機制，并探索尋找鼻咽癌新的miRNA活性特異性治療靶點的可行性。

材料和方法

1實驗材料

人高分化鼻咽癌CNE-1細胞株(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)。RPMI-1640培養基、OPTI-MEM I培養基、胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco)；PBS緩沖液(Thermo)；CCK-8試劑盒(Bryotime)；總RNA抽提試劑TRIzol、轉染試劑Lipofectamine 2000(Lipo 2000)及miRNA第一鏈合成試劑盒(Invitrogen)；cDNA第一鏈合成試劑盒和RealMasterMix(SYBR Green)熒光定量PCR試劑盒(Tiangen)；兔抗人GAPDH、Bax、Bcl-2單克隆 I 抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 II 抗(Bioworld)。miRNA-7模擬物及陰性對照(negtive control，NC)序列由廣州銳博生物合成。

2主要方法

2.1細胞培養與轉染及轉染效率的檢測CNE-1細胞接種于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，放置于37 ℃、5% CO2的恒溫恒濕培養箱中培養。實驗共分為3組：miRNA-7組；NC組；空白對照 (mock)組。將CNE-1細胞以每孔3×105接種到6孔板中，每孔2.5×103接種到96孔板中，培養24 h后更換新鮮培養基，并按操作說明以等量OPTI-MEM I無血清培養基分別稀釋適當量的miRNA-7/NC與Lipo 2000，輕輕混勻后室溫靜置5 min，再將兩者輕輕混勻于室溫下共孵育15～20 min，加入6孔板中繼續培養。如若轉染帶熒光的Cy3-miRNA-7或Cy3-NC時，所有實驗操作均需避光，并以錫箔紙包被6孔板放置于培養箱中培養，轉染24 h后用PBS沖洗，于熒光顯微鏡下觀察大致轉染效率并拍照。

2.2Real-time PCR檢測轉染后細胞中miRNA-7的相對表達情況各組CNE-1細胞經轉染處理48 h后，提取細胞總RNA，紫外分光度計下測A260/A280比值處于1.8～2.1之間的RNA即符合純度要求。配制miRNA逆轉錄液合成cDNA，并稀釋10倍待用，配制 real-time PCR反應體系，每個樣本設3個復孔。PCR反應步驟為95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環，并以U6作為內參照。記錄各孔Ct值，取各孔平均值作為最終結果，并采用2-ΔΔCt法進行分析。miRNA-7的上游引物序列為5’-AAA-AAGAACACGTGGAAGGATAG-3’，下游引物序列為5’-CCGCCTAACGTACCGCGAATTT-3’。U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2.3CCK-8法檢測轉染后的細胞活力取96孔板按上述轉染法處理各組CNE-1細胞，于空白孔中加無細胞的完全培養基(每個實驗組取4個復孔)，培養48 h后向每孔中加入10 μL CCK-8試劑，混勻后放置于培養箱中培養1～2 h，測450 nm波長下每孔的吸光度(A)值。

2.4Hoechst 33258熒光染色法檢測各組細胞凋亡情況將處于對數生長期的CNE-1細胞以每孔3×105個接種于放有蓋玻片(多聚賴氨酸包被)的6孔板內，待24 h后分別轉染，經轉染24 h后，吸去培養基，PBS輕洗2次，每孔加4%多聚甲醛1 mL，于4 ℃固定10 min，從6孔板中取出玻片，吸水紙吸去多余固定液，避光條件下每個玻片滴加Hoechst 33258染液100 μL，室溫下孵育10 min，吸水紙吸去多余染液，熒光顯微鏡下觀察、攝像。每個濃度設3個復孔。在熒光顯微鏡下觀察。

2.5Real-time PCR檢測Bax和Bcl-2 mRNA的表達情況抽提各組CNE-1細胞總RNA，配制逆轉錄反應液合成cDNA后，采用SYBR Green熒光染料法配制PCR反應體系，每組設置3個復孔。PCR反應步驟：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，共設置40個循環。反應以GAPDH作為內參照。記錄各孔Ct值，取3孔平均值作為最終結果，并采用2-ΔΔCt法進行分析。GAPDH的上游引物序列為5’- CAT CAGCAATGCCTCCTGCAC-3’，下游引物序列為5’-TGAGTCCTTCCACGATACCAAAGTT-3’； Bax的上游引物序列為5’-ATGGAGCTGCAGAGGATTCG-3’，下游引物序列為5’-AATGTCCAGCCCATGATGGT-3’；Bcl-2的上游引物序列為5’-GACTTCGCCGAGATGTCCAG-3’，下游引物序列為5’-CGGTGCTTGGCAATTAGTGG-3’。

2.6Western blot檢測Bax和Bcl-2蛋白表達情況于6孔板中轉染各組CNE-1細胞72 h后，胰酶消化收集細胞，PBS洗滌1次后加入200 μL 1×SDS loading buffer，反復吹打攪拌至細胞充分裂解，95 ℃～100 ℃煮沸10 min，10 000 r/min離心10 min，收集上清液作為樣本蛋白。按順序加樣，電泳分離，濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉4℃封閉1.5 h，TBST充分洗膜，加特異性 I 抗(GAPDH，1∶10 000稀釋；Bax和Bcl-2均1∶1 000稀釋)，放置于4 ℃孵育過夜，加入 II抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育1.5 h，TBST充分洗膜，加入ECL發光液2 min后于ImageQuant LAS 4000 Mini凝膠成像儀中自動曝光，并分析各條帶灰度值，計算各條帶組與內參照GAPDH灰度的相對比值。重復3次實驗取平均值。

3統計學處理

實驗結果采用SPSS 19.0進行分析，所有計量資料結果均以均數±標準差(mean±SD)表明，多個樣本均數之間采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行檢驗，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)進行分析，所有統計結果均以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1細胞轉染情況

如圖1所示，用帶有Cy3熒光蛋白的Cy3-miRNA-7或 Cy3-NC轉染人鼻咽癌CNE-1細胞24 h后，于熒光顯微鏡下拍照并觀察大致轉染效率，觀察到轉染效率在90%左右。

Figure 1.The expression of Cy3 fluorescin in human nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells 24 h after transfection (×100).

圖1鼻咽癌CNE-1細胞轉染24 h后熒光顯微鏡下Cy3熒光蛋白的表達情況

2miRNA-7在CNE-1細胞中的表達情況

miRNA-7在miRNA-7組、NC組及mock組中相對于U6的表達量分別為136.00±1.28、1.06±0.03和1.12±0.02，顯示轉染后miRNA-7組miRNA-7的表達量相對NC 組及Mock組呈明顯上調趨勢(P<0.01)，NC組和Mock組之間則差異不明顯，見圖2。

Figure 2.The expression of miRNA-7 in human nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells after transfection with miRNA-7 mimics. Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs miRNA-7.

圖2轉染后人鼻咽癌CNE-1細胞中miRNA-7的相對表達情況

3miRNA-7抑制CNE-1細胞活力

CNE-1細胞經轉染miRNA-7/NC處理48 h后，miRNA-7組的A值明顯小于NC組和mock組，差異有統計學顯著性(P<0.01)，而NC組和mock組之間相比則差異無統計學顯著性，見圖3。

Figure 3. The activity of human nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells 48 h after transfection with miRNA-7 mimics was detected by CCK-8 assay.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs miRNA-7.

圖3CCK-8法檢測轉染miRNA-7 48 h后各組細胞活力的變化

4miRNA-7促進CNE-1細胞凋亡形成的情況

如圖4所示，NC和mock組鼻咽癌CNE-1細胞經Hoechst 33258染色后可見細胞核大小較均一，呈圓形或橢圓形，染色質分布均勻，紫外光下呈淡藍色熒光；而miRNA-7組細胞可見染色質凝聚且分布不均勻，呈顆粒團狀分布，部分細胞核縮小，有的核碎裂形成多個球形顆粒，出現較多的凋亡細胞，表現為亮藍色的核固縮和核碎裂呈分葉狀。NC組和mock組則無明顯細胞核破壞現象。

Figure 4. Nuclear morphological changes observed by Hoechst staining 24 h after transfection with miRNA-7 mimics or negative control (×400).

圖4Hoechst染色檢測各組細胞轉染24 h后的核形態變化

5miRNA-7對Bax/Bcl-2 mRNA表達的影響

miRNA-7組和NC組Bax的mRNA表達量相對于mock組分別為1.36±0.03、1.07±0.02，而Bcl-2的 mRNA表達量則分別為0.75±0.02、0.94±0.01，miRNA-7組CNE-1細胞中Bax的mRNA表達量與NC組和mock組相比均明顯上調，差異具有統計學顯著性(P<0.01)，而Bcl-2的mRNA表達量與NC組和mock組相比均明顯下調，差異具有統計學顯著性(P<0.01)。NC組和mock組Bax和Bcl-2 mRNA表達量之間的差異無統計學顯著性，見圖5。

Figure 5. The effect of miRNA-7 transfection on the mRNA expression of Bax/Bcl-2 in human nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells. Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs NC;##P<0.01vsmock.

圖5miRNA-7對人鼻咽癌CNE-1細胞Bax/Bcl-2 mRNA表達的影響

6miRNA-7對Bax/Bcl-2蛋白表達的影響

miRNA-7組、NC組和mock組Bax蛋白相對內參照的表達量分別為0.38±0.02、0.20±0.02和0.17±0.01，Bcl-2蛋白相對內參照的表達量則分別為0.19±0.01、0.41±0.02和0.45±0.02，提示miRNA-7組CNE-1細胞中的Bax蛋白表達量與NC組和mock組相比均明顯上調，差異具有統計學顯著性(P<0.01)，而Bcl-2的蛋白表達量與NC組和mock組相比則均明顯下調，差異具有統計學顯著性(P<0.01)。NC組和mock組的Bax和Bcl-2蛋白表達量之間的差異無統計學顯著性，見圖6。

Figure 6. The effect of miRNA-7 transfection on the protein expression of Bax/Bcl-2 in human nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells. Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs miRNA-7.

圖6miRNA-7轉染對鼻咽癌CNE-1細胞對Bax/Bcl-2蛋白表達量的影響

討論

miRNA是一類長度約19～25個寡核苷酸序列的非編碼小RNA，在真核細胞增殖、凋亡等多個生物學活動中發揮著類似癌基因或抑癌基因的作用。miRNA 可以形成復雜的網絡調控系統來調控多種mRNA，且存在一定的細胞特異性。人類細胞中僅存在幾百個miRNA，且高度保守并具有時序性，而其具體作用機制目前仍不清楚。

研究發現，miR-187*在人結腸癌細胞株中表達下調，而上調miR-187*表達量可顯著抑制結腸癌細胞增殖活性，并使結腸癌細胞周期停滯[8]。而miRNA-125a、miRNA-10、miRNA-155等均被研究發現與腫瘤的形成和發展相關。本研究針對的miRNA-7是新近發現的眾多miRNA 中的一種，其抑制腫瘤增殖、促進腫瘤細胞凋亡的相關機制已在某些腫瘤中被證實。在研究宮頸癌時發現，miRNA-7可以通過下調XIAP的表達來抑制癌細胞的增殖活力，并促進癌細胞發生凋亡[9]。此外在胃癌、乳腺癌及肝癌中miRNA-7 均可發揮一定的抑癌作用[4-6]。

在鼻咽癌CNE-1細胞中miRNA-7是否可以抑制腫瘤細胞的惡性增殖并促進細胞凋亡過程的發生呢？本研究通過體外轉染技術將miRNA-7模擬物導入鼻咽癌CNE-1細胞中進行研究。熒光顯微鏡觀察結果表明鼻咽癌CNE-1細胞的轉染效率在90%左右，而real-time PCR結果提示轉染后miRNA-7的表達量的確上調了近百倍余，表明轉染后miRNA-7在細胞內可呈現過表達狀態，這為miRNA-7在短期內發揮其強效生物學活性作用提供了有利支持。轉染48 h后，利用CCK-8法檢測各組細胞活力，結果顯示轉染miRNA-7組的鼻咽癌CNE-1細胞活力與NC組和Mock組相比明顯受抑制，這表明過表達的miRNA-7可以在體外顯著抑制鼻咽癌CNE-1細胞的活力。

Hanahan等[10]研究發現，凋亡與腫瘤的發生發展密切相關。本研究采用Hoechst 33258染色法對轉染后的細胞進行觀察分析，結果提示轉染miRNA-7組的細胞核在熒光顯微鏡下可看到較多的典型細胞凋亡特征：細胞核固縮，呈致密濃染，核破碎，呈大小不等、形態不規則的碎片狀，而NC組和Mock組的細胞核在熒光下呈淡藍色熒光，大小呈圓形或橢圓形，染色質分布均一，未出現明顯的細胞凋亡特征。這表明體外過表達miRNA-7可以顯著促進鼻咽癌CNE-1細胞凋亡過程的發生和進展。Bax及Bcl-2作為細胞內最重要的凋亡調控點之一，兩者的相對比例是誘導細胞凋亡過程發生的關鍵因素[11]。因此，為進一步探索miRNA-7促鼻咽癌CNE-1細胞發生的相關機制，本研究應用real-time PCR和Western blot法來分別檢測轉染后Bax和Bcl-2 mRNA及蛋白的表達變化，結果顯示轉染后，miRNA-7組CNE-1細胞中Bax mRNA及蛋白與NC組和mock組相比均顯著上調，而Bcl-2 mRNA及蛋白則顯著下調。這表明體外過表達miRNA-7可能通過調節Bcl-2和Bax直接的平衡關系，使Bax上調處于優勢地位，并使Bcl-2下調處于劣勢地位，進而打破CNE-1細胞內線粒體結構和功能的穩定性，使鼻咽癌CNE-1細胞的凋亡過程加速進展，最終引發腫瘤細胞凋亡壞死。

綜上所述，體外過表達miRNA-7可以顯著抑制鼻咽癌CNE-1細胞的生長，促進細胞凋亡壞死，其作用機制可能與miRNA-7調節Bcl-2/Bax直接的平衡比例關系有關。

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

miRNA-7-mediated Bax/Bcl-2 expression promotes apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells

SUN Dong-xun1, HUANG Dong-dong1, JIN Qiao-zhi2, CHEN Wu-bing2, CAI Zhi-yi2

(1TheFirstHospitalofJiaxing,Jiaxing314000,China;2DepartmentofOtolaryngology,TaizhouMunicipalHospital,Taizhou318000,China.E-mail:caizy008@tom.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the relationship of microRNA-7 (miRNA-7) over-expression and Bax/Bcl-2 expression in human nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells.METHODS: The CNE-1 cells were transfected with miRNA-7 mimics using Lipofectamine 2000. The expression of miRNA-7 was detected by real-time PCR. CCK-8 assay and Hoechst 33258 staining were used to detect the cell activity and apoptosis. The expression of Bax/Bcl-2 at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blot. RESULTS: The expression of miRNA-7 was increased significantly in the CNE-1 cells compared with negative control group and mock group (P<0.01). The activity of CNE-1 cells were extremely decreased after tansfected with miRNA-7 mimics (P<0.01). The typical apoptotic nuclear morphological changes were observed in the CNE-1 cells under the fluorescence microscope with Hoechst 33258 staining. The expression of Bax at mRNA and protein levels was significantly increased compared with the other 2 groups (P<0.01), while the Bcl-2 expression at mRNA and protein levels was significantly down-regulated (P<0.01).CONCLUSION: Over-expression of miRNA-7 significantly inhibits the growth and promotes the apoptosis of nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells by increasing the expression of Bax and down-regulating Bcl-2.

[KEY WORDS]MicroRNA-7; Bax; Bcl-2; Nasopharyngeal carcinoma; Apoptosis

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0933- 05

[收稿日期]2015- 03- 20[修回日期] 2016- 03- 21

*[基金項目]浙江省醫藥衛生科技項目(No. 2013KYB293)

通訊作者△Tel: 0576-88858023； E-mail: caizy008@tom.com

[中圖分類號]R730.23

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.028

雜志網址： http://www.cjpp.net