PTEN、VEGF、COX-2與JAK2 V617F突變陽性骨髓增殖性腫瘤血管新生*

成志勇，　付建珠，　徐　倩，　趙亞玲，　劉桂敏，　卞永生，　梁麗青，　萬建設,　張麗軍

(1保定市第一醫院血液內科, 河北 保定 071000； 2承德醫學院, 河北 承德 067000)

?

PTEN、VEGF、COX-2與JAK2 V617F突變陽性骨髓增殖性腫瘤血管新生*

成志勇1△，付建珠1,2，徐倩1,2，趙亞玲1,2，劉桂敏1,2，卞永生1，梁麗青1，萬建設1,張麗軍1,2

(1保定市第一醫院血液內科, 河北 保定 071000；2承德醫學院, 河北 承德 067000)

[摘要]目的： 觀察PTEN、VEGF、COX-2在JAK2 V617F突變陽性骨髓增殖性腫瘤(MPN)患者骨髓中的表達與血管新生之間的相互關系。方法: 收集保定市第一醫院住院及門診42例JAK2V617F陽性的MPN患者(初治組27例，治療組15例)，其中原發性血小板增多癥(ET)17例，真性紅細胞增多癥(PV)10例，原發性骨髓纖維化(PMF)15例；此外，選取10例特發性血小板減少性紫癜(ITP)患者作為對照。Real-time PCR檢測突變型與野生型JAK2比值。免疫組化檢測患者及對照骨髓病理切片p-JAK2、PTEN、VEGF、COX-2的蛋白水平及CD105標記的微血管密度(MVD)。結果: 初治患者p-JAK2、VEGF、COX-2及MVD水平明顯高于對照組，而PTEN表達水平明顯低于對照組。治療組患者p-JAK2、VEGF、COX-2及MVD的水平明顯低于初治組，但PTEN表達水平高于初治組。JAK2 V617F突變量與VEGF、COX-2及MVD呈正相關(P<0.05)。PTEN與VEGF及MVD負相關(P<0.05)。JAK2突變型與野生型比值≥0.5的患者p-JAK2、VEGF、COX-2及MVD均明顯高于比值<0.5的患者，而PTEN與上述相反。結論: PTEN、VEGF、COX-2與JAK2 V617F共同參與了骨髓增殖性腫瘤患者血管新生。

[關鍵詞]骨髓增殖性腫瘤； JAK2 V617F； VEGF； 微血管密度； 血管新生

骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasms，MPNs)是一系或多系分化相對成熟的骨髓細胞克隆性增殖所致的一組腫瘤性疾病。在大部分真性紅細胞增多癥(polycythemia vera，PV)及半數原發性血小板增多癥(essential thrombocythema，ET)、原發性骨髓纖維化(primary myelofibrosis，PMF)患者存在JAK2 V617F突變。該突變導致JAK2自發性磷酸化，激活細胞因子受體-JAK2-STAT5信號通路，誘導骨髓細胞克隆性增殖[1]。

血管新生是血管內皮細胞在促血管新生因子作用下，通過與其受體結合，刺激血管內皮細胞增殖和遷移，形成新生血管的過程[2]。研究表明部分血液系統惡性腫瘤的發生發展及預后與骨髓血管新生程度及其調控因子密切相關[3]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管生成的關鍵調控因子，與多種血管新生因子相互協同刺激血管內皮細胞的遷移、增殖[4]。環氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)在包括惡性血液病在內的多種腫瘤中表達增加，JAK/STAT信號通路的激活能使COX-2過表達，誘發腫瘤血管新生[5]。

與張力蛋白同源10號染色體缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin hemology deleted on chromosome ten，PTEN)基因作為抑癌基因，在調控腫瘤細胞或正常細胞生長、凋亡、黏附、浸潤、遷移等方面具有重要生理、病理作用。它主要通過抑制PI3K/Akt信號通路磷酸化發揮抑制腫瘤作用。在包括白血病在內的多種腫瘤細胞中存在PTEN表達降低，并與腫瘤預后不良密切相關[6]。PTEN能夠抑制包括惡性血液病在內的多種腫瘤的血管新生[7]。

本研究探討了PTEN、VEGF、COX-2在JAK2 V617F突變陽性骨髓增殖性腫瘤患者骨髓中的表達與血管新生之間的相互關系，為抗血管新生治療惡性血液病提供了理論依據。

材料和方法

1臨床資料

選取2012年1月～2014年10月于保定市第一醫院收治的42例JAK2 V617F突變陽性的MPN患者，其中男18例，女24例，年齡32～75歲，中位年齡57歲；其中PV 10例，ET 17例，PMF 15例；包括初治組25例(未經任何治療的初治MPN患者)，治療組17例(經IFN-α 2b)。10例特發性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)患者作為對照，男5例，女5例，中位年齡40歲。所有實驗均獲得患者知情同意。

治療組所用治療方案：MPN患者應用IFN-α 2b皮下或肌肉注射，每次3×106U，每周3～7次，至少應用6個月以上，必要時應用羥基脲調整白細胞、血紅蛋白及血小板數量。

2試劑

p-JAK2和COX-2抗人單克隆抗體購自Santa Cruz；CD105和VEGF單克隆抗體購自中杉金橋公司；CCK-8購自Dojindo；血液基因組DNA提取試劑盒購自北京博邁德生化科技有限公司；引物序列根據NCBI公布的相應基因序列設計并由北京賽百盛公司合成；TaqMan購自ABI。

3方法

3.1Real-time PCR采集新鮮骨髓液4 mL，肝素抗凝。DNA提取試劑盒提取基因組DNA。real-time PCR反應體系共25 μL。反應條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。同時設標準品和空白對照。PCR反應前3～15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，調節基線至適宜處作為閾值，各熒光信號到達所設定閾值的循環數即為Ct值。根據標準品計算JAK2和JAK2 V617F的絕對拷貝數量。計算JAK2 V617F/JAK2比值。PCR引物序列及探針如下：JAK2上游引物為5′-CAG CAA GTA TGA TGA GCA AGC TTT-3′，下游引物為5′-TGA ACC AGA ATA TTC TCG TCT CCA C-3′；MGB-Probe為 5′-FAM-TCA CAA GCA TTT GGT TTT-MGB-3′，JAK2 V617F下游引物為5′-CCA GAA TAT TCT CGT CTC CAC TGA A-3′。

3.2免疫組織化學染色組織蠟塊4 μm切片，45 ℃烤片3 h，脫蠟，蒸餾水沖洗2遍，抗原修復后加3%過氧化氫，阻斷內源性過氧化氫酶的活性，PBS沖洗3次，加入 I 抗(p-JAK2、VEGF和CD105抗體工作濃度分別為1∶200、1∶200和1∶50)4 ℃過夜，PBS沖洗3次，每次 5 min，滴加EliVision Plus試劑盒中試劑A(增強劑)、試劑B(酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物)，PBS沖洗后，加DAB顯色，以胞膜、胞漿或胞核中出現棕黃色顆粒為陽性判斷標準，蘇木素復染，0.1%鹽酸分化，自來水沖洗，切片經梯度乙醇脫水干燥，中性樹膠封片。

3.3免疫組化判定標準以細胞胞漿內出現棕色染色顆粒為陽性。選取3個高倍鏡視野區域(×400)，計算陽性細胞數占全部細胞的比例。

3.4微血管密度(microvessel density，MVD)結果判定顯微鏡下，任何被染成棕褐色的單個內皮細胞或細胞團，不管是否形成管腔，只要與組織成分有一個清楚的分離，即判定為微血管。選定3個微血管密集區，在高倍鏡視野區域(×400)計數微血管數，取均值表示MVD。

4統計學處理

所有數據用SPSS 19.0統計軟件分析處理。兩樣本均數比較采用 t 檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較選用SNK-q檢驗。Spearman等級相關分析各變量之間的相關性。以 P<0.05 為差異有統計學意義。

結果

1JAK2 V617F突變在患者中的表達

42例患者在初次治療時均經定量PCR檢測為JAK2 V617F突變陽性，經過治療后2例患者JAK2 V617F突變轉陰性，除此2例患者外，其余40例MPN患者突變量在26.8%～75.4%之間。其中初治組25例，突變量為(46.17±19.32)%，干擾素治療組17例，突變量為(22.69±12.64)%，前者明顯高于后者(P<0.05)。

2免疫組織化學染色檢測p-JAK2、VEGF、COX-2、PTEN和MVD在MPN患者中的水平

p-JAK2、VEGF和COX-2及PTEN蛋白均定位于細胞質，其中p-JAK2、VEGF和COX-2 的陽性率在初治組中最高，其次為治療組，對照組最低，差異均有統計學顯著性(P<0.01)；MVD在初治組中顯著高于治療組及對照組；PTEN蛋白在初治組中表達最低，其次為治療組，對照組表達最高，差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The levels of p-JAK2, PTEN, VEGF, COX-2 proteins and MVD in control group， newly diagnosed group and treatment group detected by immunohistochemistry (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1免疫組織化學染色檢測p-JAK2、VEGF、COX-2、PTEN蛋白及MVD水平

3JAK2 V617F突變量與p-JAK2、VEGF、COX-2、PTEN和MVD的相關分析

Spearman等級相關分析顯示MPN患者的JAK2V617F突變量與p-JAK2、VEGF、COX-2和MVD呈正相關，相關系數分別為0.739、0.589、0.553和0.577(P<0.05)，與PTEN呈負相關(r=-0.508，P<0.05)。PTEN蛋白表達與MVD呈負相關(r=-0.584，P<0.05)。

以JAK2 V617F/JAK2比值50%為界值分為<50%及≥50%兩組，其中<50%組26例，≥50%組16例，見表1。結果顯示JAK2 V617F/JAK2<50%的患者其p-JAK2、VEGF、COX-2及MVD的水平均明顯低于JAK2 V617F/JAK2≥50%組，PTEN在JAK2 V617F/JAK2比值<50%患者的水平要明顯高于JAK2 V617F/JAK2比值≥50%患者(P<0.05)。

IFN-α 2b治療組JAK2 V617F突變量及p-JAK2、VEGF、COX-2、MVD的水平均明顯低于初治組但高于對照組(P<0.05)；而PTEN與上述相反，在初治組中表達最低，其次為治療組，在對照組中表達最高(P<0.05)，見表2。

表1　JAK2 V617F/JAK2突變量與PTEN、VEGF、COX-2及MVD的關系

*P<0.05,**P<0.01 vs JAK2 V617F/JAK2<50% group.

表2初治組、治療組及對照組JAK2 V617F與PTEN、VEGF、COX-2、MVD表達水平的關系

Table 2.The relationship between JAK2 V617F mutation and PTEN, VEGF, COX-2, and MVD in newly diagnosed group, treatment group and control group (Mean±SD)

GroupnJAK2V617F/JAK2(%)PTEN+(%)VEGF+(%)COX-2+(%)MVDNewlydiag-nosed2546.17±19.3224.78±14.8664.72±25.0165.66±20.1526.58±5.93Treatment1722.69±12.64*38.72±18.25*36.58±15.95*44.30±12.83*15.86±4.27*Control100*55.05±21.17*25.69±13.75*32.89±10.54*10.76±4.01*

*P<0.05 vs newly diagnosed group.

4JAK2 V617F及MVD與血栓栓塞的相關性

42例患者發生血栓患者19例，血栓發生率為45.24%，以JAK2 V617F/JAK2比值<50%組26例，血栓栓塞8例，血栓發生率為30.77%，≥50%組16例，血栓栓塞11例，血栓發生率為68.75%，后者明顯高于前者(P<0.05)。42例患者總MVD為22.24±7.49，其中MVD<22.24患者23例，血栓栓塞7例，血栓發生率為為30.43%，MVD>22.24患者19例，血栓栓塞12例，血栓發生率為63.16%，后者明顯高于前者(P<0.05)。結果表明JAK2 V617F突變量愈高，MVD愈高，患者血栓栓塞發生率愈高。

討論

JAK2突變為BCR-ABL陰性骨髓增殖性腫瘤患者常見的基因突變，該突變在缺少細胞因子情況下能自發性激活JAK2-STAT5信號通路，從而誘發骨髓增殖性腫瘤，而以JAK2 V617F點突變最為常見。受體鼠表達JAK2 V617F可以產生類似PV和MF表型，支持JAK2 V617F在MPN發病機制中的重要作用[8]。本研究所選患者在初次治療時均經定量PCR檢測為JAK2 V617F突變陽性，經過治療后2例患者JAK2 V617F突變轉陰性，其余40例MPN患者突變量在26.8%～75.4%之間。

血管新生在多種惡性血液病如白血病、骨髓瘤發病中發揮重要作用，與腫瘤的預后密切相關[3]。血管新生的機制表現在促血管生成因子的活性上調和(或)血管生成抑制因子的活性下調[2]。VEGF是腫瘤血管新生過程中最重要的調控因素。在腫瘤細胞中通過自分泌與旁分泌途徑，VEGF與其受體結合，能夠促進腫瘤細胞的增殖和轉移以及血管新生[9]。

在惡性血液病在內的多種腫瘤中COX-2表達增加，能夠刺激腫瘤細胞的增殖、抑制腫瘤細胞凋亡；促進腫瘤內血管形成；促黏附和轉移，增加腫瘤細胞的侵襲力[5]。VEGF與COX-2存在廣泛的多通路聯系。研究表明VEGF與COX-2基因之間存在頻繁的共區域化，從而提示二者存在共同控制2個基因表達的機制[10]。同時2者能夠相互促進，發揮協同誘導腫瘤血管新生作用[11]

抑癌基因PTEN具有抑制包括白血病在內的腫瘤血管新生作用，并降低腫瘤微血管密度，抑制多種促血管生成因子，如VEGF、HIF-1、COX-2等在腫瘤細胞表達[7,12]。過表達PTEN蛋白能夠抑制雞胚尿囊膜血管新生[7]。

研究表明在骨髓增殖性腫瘤患者骨髓中微血管密度明顯高于正常人[2, 9, 13-14]。同時存在VEGF及其受體高表達，MVD隨著JAK2 V617F突變量的增加而增加[9, 13-14]。本研究結果顯示，JAK2 V617F突變陽性患者中存在促血管新生因子VEGF和COX-2高表達，同時MVD明顯增加。而抑癌基因PTEN表達水平明顯減低。相關分析顯示MPN患者的JAK2 V617F突變量與VEGF、COX-2和MVD呈正相關，與PTEN表達呈負相關，JAK2 V617F突變率越高者VEGF和COX-2表達越高，MVD越高則血管新生越明顯，而PTEN表達愈低。JAK2 V617F是BCR-ABL陰性MPN發病機制之一，隨著JAK2-STAT5信號通路活化，細胞克隆性增生，骨髓細胞分泌大量促血管新生因子如VEGF和COX-2，伴隨PTEN等血管新生抑制因子的表達降低，骨髓微血管新生平衡進一步打破，骨髓微血管密度進一步增加，從而介導了MPN的發病。同時JAK2 V617F突變量愈高，骨髓微血管密度愈高，患者發生血栓的風險則愈高[15]。

IFN-α 2b具有抗腫瘤作用。目前研究表明約80%的MPN患者在應用IFN-α 2b后可獲得血液學反應，能夠減少JAK2 V617F的突變量，甚至部分患者能夠達到分子生物學緩解[16]。本研究結果顯示，在JAK2 V617F陽性MPN患者在應用IFN-α 2b后JAK2 V617F突變量明顯減少，部分患者轉陰性。同時能夠降低MPN患者VEGF及COX-2及MVD表達。隨著JAK2 V617F突變量的減低，PTEN表達水平亦伴隨升高。

本研究我們初步探討了JAK2 V617F陽性骨髓增殖性腫瘤中促血管新生因子VEGF、COX-2及抑制血管新生因子PTEN與骨髓微血管密度之間相互關系及與JAK2 V617F突變量之間相互聯系，為抗血管新生治療骨髓增殖性腫瘤提供了理論依據。

[參考文獻]

[1]成志勇，黃月華，梁文同，等. 骨髓增殖性腫瘤中JAK2 V617F 突變與Ⅰ型細胞因子受體相關性研究[J]. 中國全科雜志, 2012, 15(9):1019-1022.

[2]Medinger M， Passweg J. Angiogenesis in myloproliferative neoplasma, new markers and future directions[J]. Memo, 2014, 7:206-210.

[3]AbdElAal AA, Afify RA, Zaher AE, et al. Study of prognostic significance of marrow angiogenesis assessment in patients with de novo acute leukemia[J]. Hematology, 2015, 20(9):504-510.

[4]Moschetta MG, Maschio LB, Jardim-Perassi BV，et al. Prognostic value of vascular endothelial growth factor and hypoxia-inducible factor 1α in canine malignant mammary tumors[J]. Oncol Rep, 2015, 33(5):2345-2353.

[5]Yu H, Liu Z, Zhou H, et al. JAK-STAT pathway modulates the roles of iNOS and COX-2 in the cytoprotection of early phase of hydrogen peroxide preconditioning against apoptosis induced by oxidative stress[J]. Neurosci Lett,2012, 529(2):166-171.

[6]Wang SY, Hao HL, Deng K, et al. Expression levels of PTEN, FAK in multiple myeloma patients and its relationship with clinical stage and extramedullary infiltration[J]. Leuk Lymphoma, 2012, 53(6):1162-1168.

[7]Cheng ZY, Liang WT, Yang XY, et al. PTEN’s regulation of VEGF and VEGFR1 expression and its clinical significance in myeloid leukemia[J]. Med Oncol, 2012, 29(2):1084-1092.

[8]Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, et al. A gain-of-function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders[J]. N Engl J Med, 2005,352(17):1779-1790.

[9]Medinger M, Skoda R, Gratwohl A, et al. Angiogenesis and vascular endothelial growth factor-/receptor expression in myeloproliferative neoplasms: correlation with clinical parameters and JAK2-V617F mutational status[J]. Br J Haematol, 2009, 146(2):150-157.

[10]Butkiewicz D, Krzeniak M, Drosik A, et al. The VEGFR2, COX-2 and MMP-2 polymorphisms are associated with clinical outcome of patients with inoperable non-small cell lung cancer[J]. Int J Cancer, 2015, 137(10):2332-2342.

[11]Hua KT, Lee WJ, Yang SF, et al. Vascular endothelial growth factor-C modulates proliferation and chemoresistance in acute myeloid leukemic cells through an endothelin-1-dependent induction of cyclooxygenase-2[J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1843(2):387-397.

[12]Sui W, Zhang Y, Wang Z, et al. Antitumor effect of a selective COX-2 inhibitor, celecoxib, may be attributed to angiogenesis inhibition through modulating the PTEN/PI3K/Akt/HIF-1 pathway in an H22murine hepatocarcinoma model[J]. Oncol Rep, 2014, 31(5):2252-2260.

[13]Boiocchi L, Vener C, Savi F, et al. Increased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 correlates with VEGF and microvessel density in Philadelphia chromosome-negative myeloproliferative neoplasms[J]. J Clin Pathol, 2011, 64(3):226-231.

[14]Boveri E, Passamonti F, Rumi E, et al. Bone marrow microvessel density in chronic myeloproliferative disorders: a study of 115 patients with clinicopathological and molecular correlations[J]. Br J Haematol, 2009, 140(2):162-168.

[15]郭慧梅，潘崚，賀建輝，等. 骨髓增殖性腫瘤患者血栓栓塞的相關因素[J]. 腫瘤防治研究, 2013, 40(10):958-960.

[16]成志勇，李士輝，楊琳，等. 干擾素α對JAK2 V617陽性的骨髓增殖性疾病的影響[J]. 實用腫瘤雜志, 2008, 23(4):318-321.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

PTEN, VEGF, COX-2 and angiogenesis in JAK2 V617F positive myeloroliferative neoplasms

CHENG Zhi-yong1, FU Jian-zhu1, 2, XU Qian1, 2, ZHAO Ya-ling1, 2, LIU Gui-min1, 2, BIAN Yong-sheng1, LIANG Li-qing1, WAN Jian-she1, ZHANG Li-jun1,2

(1DepartmentofHematology,TheFirstHospitalofBaoding,Baoding071000,China;2ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China.E-mail:dzczy@sohu.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the expression of PTEN, VEGF and COX-2, and the relationship with angiogenesis in the bone tissues of JAK2 V617F mutation positive myeloroliferative neoplasm(MPN)patients. METHODS: JAK2 V617F positive MPN patients (n=42) were selected in the First Hospital of Baoding including 25 cases of newly diagnosed group and 17 cases of treatment group with IFN-α 2b, and 10 cases of idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) patients served as controls. The ratio of mutant and wild type JAK2 was detected by real-time PCR. The protein levels of p-JAK2, PTEN, VEGF and COX-2, and microvascular density (MVD) marked with CD105 in pathological tissues of bone marrow were detected by immunohistochemistry. RESULTS: The levels of p-JAK2, VEGF, COX-2 and MVD in newly diagnosed group were significantly higher than those in control group. However, the expression level of PTEN was significantly lower than that in control group. The levels of p-JAK2, VEGF, COX-2 and MVD in treatment group were significantly lower than those in newly diagnosed group, while the expression level of PTEN was significantly higher than that in newly diagnosed group. JAK2 V617F mutation burden was positively correlated with VEGF, COX-2 and MVD (P<0.05). PTEN was negatively correlated with VEGF and MVD (P<0.05). The levels of p-JAK2, VEGF, COX-2 and MVD in JAK2 V617F/JAK2 ratio≥0.5 group were significantly higher than those in JAK2 V617F/JAK2 ratio<0.5 group, but PTEN showed the contrary to the above.CONCLUSION: PTEN, VEGF, COX-2 and JAK2 V617F are involved in the pathogenesis of angiogenesis in MPN patients.

[KEY WORDS]Myeloroliferative neoplasms; JAK2 V617F; VEGF; Microvascular density; Angiogenesis

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0938- 05

[收稿日期]2015- 07- 10[修回日期] 2016- 01- 12

*[基金項目]河北省重點研發計劃項目(No. 162777120D)

通訊作者△Tel: 0312-2096686; E-mail: dzczy@sohu.com

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.029

雜志網址： http://www.cjpp.net