鹽酸右美托咪啶對缺血再灌注腎損傷小鼠的腎小管保護作用

卜林，陳艷

（徐州醫學院附屬醫院1.重癥醫學科，2.腎臟內科，江蘇徐州221003）

?

鹽酸右美托咪啶對缺血再灌注腎損傷小鼠的腎小管保護作用

卜林1，陳艷2

（徐州醫學院附屬醫院1.重癥醫學科，2.腎臟內科，江蘇徐州221003）

摘要：目的缺血再灌注腎損傷（IR）是圍手術期常見的疾病，本研究通過構建缺血再灌注腎損傷模型，觀察右美托咪啶（Dex）注射對受損腎小管的保護作用及機制。方法將60只小鼠隨機分為對照組、IR模型組和IR+Dex組（簡稱Dex組），制備IR模型后24 h分別處死3組小鼠取腎組織。用全自動生化分析儀測定血肌酐（Scr）及尿素氮（BUN）。采用HE染色觀察各組小鼠腎組織的形態，評定腎小管損傷程度；免疫組織化學染色測定低氧誘導因子-1α（HIF-1α）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的表達。結果對照組的腎小管結構與形態均正常。IR模型組腎小管損害明顯、HIF-1α及MCP-1表達均增高。而Dex組腎小管損害程度較輕，HIF-1α及MCP-1表達均較IR模型組減低，腎小管上皮細胞低氧程度及炎癥反應均較IR模型組明顯減輕。Dex組小鼠的血肌酐及尿素氮水平較IR模型組明顯降低。結論Dex可以通過抑制炎癥反應、減輕腎小管上皮細胞低氧程度從而減輕IR小鼠腎小管的損害，保護腎臟功能。

關鍵詞：缺血再灌注損傷；腎小管上皮細胞；右美托咪啶

圍手術期急性腎損害（acute kidney injury，AKI）主要由包括手術在內的各種原因引起的腎臟缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）所致，表現為腎小球濾過率急劇減少，出現氮質血癥［1］。AKI是圍手術期常見的并發癥之一，也是重癥監護病房（intensive care unit，ICU）常見的急危重癥。腎臟缺血再灌注不僅使自身受損，還導致多器官功能障礙。盡管目前診治手段大大改善，但AKI的發病率和病死率仍居高不下，造成住院時間延長，診治費用增加，死亡率增高。

右美托咪啶（Dexmedetomidine，Dex）是一種新型的、特異性、高選擇性α2腎上腺素能受體激動劑，具有鎮靜、鎮痛、抗交感、穩定血流動力學和利尿作用［2-3］，目前主要用于ICU鎮靜和臨床麻醉。本實驗通過觀察Dex注射對受損腎小管的保護作用及其機制，旨在為臨床圍手術期防治AKI發生提供新的理論和應用依據。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1動物昆明小鼠60只，清潔級，體重20～25 g，由徐州醫學院實驗動物中心提供。

1.1.2主要試劑兔抗免疫組織化學染色測定低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），β-Tubulin（美國Santa Cruz公司），兔抗單核細胞趨化蛋白1（mononuclear macrophage antigen 1，MCP1）單克隆抗體（Boster Biotechnology公司）。

1.2方法

1.2.1模型制備與分組將60只小鼠隨機分為對照組、IR模型組和Dex組，每組20只。對照組：不做任何處理；IR模型組：用1.5%異氟烷誘導麻醉小鼠后將其放置于變溫毯上，維持體溫（36.0±0.1）℃。常規備皮、消毒。沿腹部正中剪開皮膚，暴露腹白線，沿之剪開后暴露腹腔。輕輕推移腎周組織后分別用微血管夾夾閉左、右側腎蒂，可以看到兩側腎臟顏色由鮮紅變成暗紅。然后將腎周組織歸位，開放的腹腔用濕紗布覆蓋。待雙側腎臟缺血25 min后，移除微血管夾，讓腎臟重獲血液灌注，可以看到腎臟顏色由暗紅變成鮮紅。縫合關閉腹腔。24 h后處死小鼠，取出腎組織備檢。Dex組：在IR模型組中腎臟獲得再灌注后立即給予腹腔注射Dex 25.0μg/kg。

1.2.2腎組織形態學檢查常規石蠟包埋，組織切片進行蘇木素-伊紅（hematoxylin-esosin，HE）染色，光學顯微鏡觀察。腎小管損傷程度分析：每個標本隨機選取10個視野，每個視野分別測量腎小管間質相對面積，按照DJUDJAJ等［4］方法，按腎小管損傷程度將組織學評分分為0～3：0=正常腎組織；1=中等程度損傷；3=腎小管壞死病變。進行組織學評分。

1.2.3HIF-1α及MCP1的表達標本石蠟包埋，連續切片，厚度3μm。貼附于載玻片上，60℃烤箱烘烤3 h。常規脫蠟至水后，分別經3%過氧化氫H2O2封閉，消除內源性過氧化物酶的活性。一抗：兔抗HIF-1α多克隆抗體（1∶100）、兔抗MCP1單克隆抗體（1∶100）；二抗：IgG即用型M.0.M.TM免疫組織化學試劑盒，按ABC法進行染色，DAB顯色。均采用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。每張切片隨機選取5個高倍視野（×400），利用Image-Pro Plus 6.0軟件計算其積分光密度值（integral optical density，IOD），取其平均值。

1.2.4Western blot檢測HIF-1α表達取新鮮腎組織加裂解液后勻漿、離心、取上清液測蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、封閉，加一抗、二抗，顯色劑顯色處理。以β-Tubulin為參照，測定HIF-1α蛋白的相對表達量，即各組HIF-1α/β-Tubulin ratio值之間比較。

1.2.5腎功能變化在處死小鼠同時每只取靜脈血2 ml，在高速離心機上離心，吸取血清，在全自動生化分析儀上檢測BUN及Scr。

1.3統計學方法

采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）描述；組間均數比較采用單因素方差分析。以α=0.05為檢驗水準，當P＜0.05時，差異有統計學意義。

2　結果

2.1腎臟形態學變化

各組小鼠腎組織HE染色顯示：對照組小鼠腎組織結構形態正常；IR模型組出現不同程度的腎小管擴張萎縮、空泡變性，腎小管上皮細胞扁平、核染色缺失、炎癥細胞浸潤；Dex組小鼠腎臟組織病理改變較IR模型組明顯減輕。見圖1。

各組小鼠腎臟組織組織學評分結果顯示：對照組（0.23±0.01），IR模型組（4.46±0.11），Dex組（1.51± 0.04），3組間比較差異有統計學意義。見圖2。

2.2腎組織HIF-1α免疫組織化學染色

對照組腎小管上皮細胞基本正常，HIF-1α表達微弱。IR模型組腎小管上皮細胞低氧嚴重，HIF-1α表達顯著增多。Dex組小鼠腎臟組織病理改變較IR模型組明顯減輕，HIF-1α表達較IR模型組顯著減少。見圖3。

各組小鼠腎組織HIF-1α染色IOD值比較，IR模型組腎小管HIF-1α大量表達，而Dex組HIF-1α較IR模型組表達顯著減少。3組標本IOD值間比較差異有統計學意義。見圖4。

2.3腎組織MCP1免疫組織化學染色

對照組腎小管上皮細胞基本正常，MCP1表達微弱。IR模型組腎小管損傷嚴重，炎癥細胞浸潤，MCP1表達顯著增多。Dex組小鼠腎臟組織病理改變較IR模型組顯著減輕，MCP1表達較IR模型組顯著減少。見圖5。

與對照組比較，IR模型組腎小管MCP1大量表達（P=0.042）。而Dex組MCP1較IR模型組表達顯著減少（P=0.031）。3組標本IOD值間比較差異有統計學意義。見圖6，表1。

2.4HIF-1α蛋白表達

對照組HIF-1α蛋白表達微弱，IR模型組HIF-1α蛋白大量表達，而Dex組HIF-1α蛋白表達水平較IR模型組顯著降低。見圖7。

圖1　各組小鼠腎組織HE染色（×40）

圖2　各組小鼠腎小管損傷程度組織學評分

圖3　各組小鼠腎組織HIF-1α染色（×40）

圖4　各組小鼠腎組織HIF-1α染色IOD值比較

圖5　各組小鼠腎組織MCP1染色（×40）

圖6　各組小鼠腎組織MCP1染色IOD值比較

各組HIF-1α/β-Tubulin ratio值之間比較：對照組HIF-1α蛋白表達微弱，HIF-1α/β-Tubulin ratio值小，IR模型組HIF-1α蛋白大量表達，HIF-1α/β-Tubulin ratio值顯著增加，而Dex組HIF-1α蛋白表達水平較IR模型組顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖8。

2.5腎功能變化

雙腎缺血25 min再灌注24 h后，血漿肌酐水平從（30.62±2.55）μmol/L升高至（78.34±5.17）μmol/L（P =0.004），血尿素氮水平從（6.26±0.34）mmol/L升高至（23.39±4.15）mmol/L（P=0.006）。缺血再灌注后應用Dex 25μg/kg，可顯著改善IR之后的腎功能，肌酐（54.09±3.27）μmol/L（P=0.035）；尿素氮（18.33±4.07）mmol/L（P=0.023）。見表2。

表1　各組小鼠24 h免疫組織化學IOD值比較（n=20，±s）

表1　各組小鼠24 h免疫組織化學IOD值比較（n=20，±s）

注：1）與同期對照組比較，P＜0.05；2）與同期IR模型組比較，P＜0.05

組別　MCP1（×103）對照組　1.82±0.02 IR模型組　7.62±0.131）Dex組　3.87±0.052）HIF-1α（×103）0.15±0.03 0.75±0.121）0.41±0.062）

圖7　各組小鼠腎組織HIF-1α蛋白表達

圖8　各組小鼠腎組織HIF-1α蛋白表達比較

表2　24 h后3組小鼠血肌酐及尿素氮比較（n=20，±s）

表2　24 h后3組小鼠血肌酐及尿素氮比較（n=20，±s）

注：1）與同期對照組比較，P＜0.05；2）與同期IR模型組比較，P＜0.05

組別　BUN/（mmol/L）對照組　6.26±0.34 IR模型組　23.39±4.151）Dex組　18.33±4.071）2）Scr/（μmol/L）30.62±2.55 78.34±5.171）54.09±3.271）2）

3　討論

腎臟缺血再灌注損傷是一個復雜的過程，休克、體外循環術后、圍產期窒息等過程常發生腎缺血性損傷，嚴重者將導致急性腎功能衰竭的發生，也是患者入住ICU的主要原因。腎IR損傷病變的本質包括腎小管可逆性非致死性功能障礙和致死性損傷［5］。近年來，研究認為，凋亡和炎癥反應在腎IRI的病理生理過程中占有核心地位［6］。HUANG等［7］認為，炎癥反應是IRI最為主要的特征之一。而劇烈的炎癥反應導致急性腎小管壞死，壞死后的小管碎屑作為一種危險信號在循環中進一步激發炎癥反應，使腎小管上皮細胞處于缺氧狀態。因此，針對急性腎損傷的早期抗炎治療具有重要的價值［8］。

Dex是新一代α2AR激動劑，分布半衰期為約5 min，消除半衰期約2 h，不良反應相對輕且少。臨床上主要作為手術麻醉輔助藥和ICU鎮靜。此外，Dex還具有鎮痛、抑制交感興奮、抗焦慮、穩定血流動力學和利尿效應［3］。BILLINGS等［9］研究發現，Dex可以維持小鼠腎髓質血流從而防止造影劑腎病發生。KOCOGLU等［2］在腎缺血再灌注損傷大鼠研究中發現，Dex預處理可降低腎缺血再灌注損傷，提高腎臟對缺血的耐受性。因此，筆者推測，Dex能夠通過減輕腎損傷后炎癥反應、阻止腎小管上皮細胞凋亡加劇從而降低缺血再灌注后腎損傷的程度。

本實驗通過HE染色發現，對照組小鼠腎組織結構形態正常，而IR模型組出現不同程度的腎小管擴張、萎縮、空泡變性，腎小管上皮細胞扁平、核染色缺失、炎癥細胞浸潤。但Dex組小鼠腎臟組織病理改變較IR模型組明顯減輕。說明Dex本身對腎臟不會造成損傷，Dex能夠減輕IR后受損腎臟的病變程度，從一定程度上維持腎臟結構與形態的穩定，進而改善腎臟功能。

HIF-1α是迄今為止發現的唯一一個在缺氧狀態下發揮活性的特異性轉錄因子，是細胞低氧的可靠標記物，是反映低氧狀態的一個敏感指標［10］。HAUCK等［11］認為，缺氧導致細胞死亡的主要方式是通過誘導細胞凋亡來實現的。細胞內氧濃度對HIF-1α的表達進行著精細的調節，隨著氧濃度的下降，其表達增加。本研究發現，對照組HIF-1α表達較微弱，IR模型組HIF-1α大量表達，而Dex組HIF-1α較IR模型組表達顯著減少。說明Dex能夠減輕腎IR后受損腎小管上皮細胞低氧狀態，從而減輕腎臟損害。

MCP1是趨化因子CC亞家族中的一員，在正常情況下腎組織中僅有少量表達。然而，在病理狀態下，MCP1在腎小管間質中可廣泛表達。劉雷等［5］認為，MCP1啟動并放大炎癥反應過程，在腎IRI中發揮重要作用。本實驗通過研究發現，對照組MCP1表達較微弱，IR模型組MCP1大量表達，而Dex組MCP1蛋白表達水平較IR模型組顯著減少。說明Dex能夠通過減輕IR后腎組織炎癥反應，從而保護腎臟功能。從表2可以看出，Dex組小鼠腎功能較IR模型組明顯改善。

IR的炎癥反應始于缺血階段，再灌注之后補體系統被激活，引發后天免疫系統的級聯反應，促進炎癥的發展［8］，炎癥反應的發展可能會導致腎小管上皮細胞處于缺氧狀態加劇。因此，針對ARF/AKI的早期抗炎治療具有重要的價值。通過以上研究結果，筆者推測Dex參與腎臟IRI后的病理生理過程，主要通過下調MCP1和HIF-1α的表達，從而減輕腎臟炎癥反應，降低腎小管上皮細胞缺氧程度，進而保護腎臟功能。希望能夠為臨床早期防治IR后腎損傷及其他臟器損傷提供新的治療思路。

參考文獻：

［1］BORTHWICK E，FERGUSON A. Perioperative acute kidney injury：risk factors，recognition，management and outcomes［J］. BMJ， 2010，341：c3365.

［2］KOCOGLU H，OZTURK H，OZTURK H，et al. Effect of dexmedetomidine on ischemia-reperfusion injury in rat kidney：a histopathologic study［J］. Ren Fail，2009，31（1）：70-74.

［3］CAROLLO DS，NOSSAMAN BD，RAMADHYANI U. Dexmedetomidine：a review of clinical applications［J］. Curr Opin Anaesthesiol，2008，21（4）：457-461.

［4］DJUDJAJ S，CHATZIANTONIOU C，RAFFETSEDER U，et al. Notch-3 receptor activation drives inflammation and fibrosis following tubulointerstitial kidney injury［J］. J Pathol，2012，228（3）：286-299.

［5］劉雷，孟建中.單核細胞趨化蛋白-1對缺血再灌注腎損傷的影響機制［J］.國際移植與血液凈化雜志. 2007，5（5）：18-20.

［6］DAEMEN M A，DE VRIES B，BUURMAN W A. Apoptosis and inflammation in renal reperfusion injury［J］. Transplantation，2002，73（11）：1693-1700.

［7］HUANG Y，RABB H，WOMER K L. Ischemia-reperfusion and immediate T cell responses［J］. Cell Immunol，2007，248（1）：4-11.

［8］THURMAN J M. Triggers of inflammation after renal ischemia/reperfusion［J］. Clin Immunol，2007，123（1）：7-13.

［9］BILLINGS F T，CHEN S W，KIM M，et al. Alpha2-adrenergic agonists protect against radiocontrast-induced nephropathy in mice［J］. Am J Physiol，2008，295（3）：741-748.

［10］STRAVODIMOS K G，KORITSIADIS G，LAZARIS A C，et al. Hydronephrosis promotes expression of hypoxia-inducible factor 1 alpha［J］. Urol Int，2009，82（1）：38-42.

［11］HAUCK I，HANSMANN，DIETZ R，et al. Inhibition of hypoxis-induced apoptosis by modulation of retinlblastoma protein-dependent signaling in cardiomyocytes［J］. Cire Res，2002，91（9）：782-789.

（張蕾編輯）

論著

Protective effect of Dexmedetomidin on kidney injury induced by renal ischemia-reperfusion and its mechanism

Lin Bu1，Yan Chen2
（1. Intensive Care Unit，2. Department of Nephrology，the Affiliated Hospital，Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu 221003，China）

Abstract：Objective To establish a mouse model of ischemia-reperfusion injury（IRI）and to investigate the protective effects of Dexmedetomidine（Dex）injection on renal tubules，so as to provide new available methods for acute kidney injury（AKI）. Methods Sixty female mice were randomly divided into three groups∶control group，renal IRI group and Dex group，with 20 mice in each group. The mice were sacrificed at the 24th hour after surgery，then the bilateral kidneys and blood samples were collected. The blood urea nitrogen（BUN）and serum creatinine（Scr）were measured by automatic biochemistry analyzer. HE staining was used to observe the pathology of the kidneys. Immunohistochemistry and Western blot were used to detect the expression of hypoxia inducible factor-1α（HIF-1α）and monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1）. Results There was no significant changes of renal tubules in the control group. In the renal IRI group，renal tubular epithelial cells were obviously damaged，and their expressions of HIF-1α and MCP-1 noticeably increased. However，renal tubular injury in the Dex group was lighter than that of the IR group；the expressions of HIF-1α and MCP-1，the hypoxia degree and inflammatory reaction of renal tubules as well as the levels of BUN and Scr of the Dex group were lower than those of the IR group. Conclusions It maybook=2,ebook=7be naturally speculated that Dex can protect renal function through reducing inflammatory reaction and hypoxia degree of damaged renal tubular epithelial cells following renal IR.

Keywords：ischemia-reperfusion；tubular epithelial cell；Dexmedetomidin

中圖分類號：R692；R-332

文獻標識碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1005-8982.2016.10.001

文章編號：1005-8982（2016）10-0001-05

收稿日期：2015-11-23