轉染白細胞介素18基因通過下調多藥耐藥基因表達增強順鉑對C6膠質瘤細胞毒作用*

呂雨虹，陳慶，趙娟，王彥玲，祝建峰，閆蘊力

（1.河北醫科大學，河北石家莊050017；2.河北省胸科醫院，河北石家莊050041）

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轉染白細胞介素18基因通過下調多藥耐藥基因表達增強順鉑對C6膠質瘤細胞毒作用*

呂雨虹1，陳慶2，趙娟1，王彥玲1，祝建峰2，閆蘊力1

（1.河北醫科大學，河北石家莊050017；2.河北省胸科醫院，河北石家莊050041）

摘要：目的探討轉染白細胞介素18（IL18）基因對大鼠C6膠質瘤細胞順鉑化療敏感性的影響及可能的作用機制。方法體外培養轉染IL18基因的C6/IL18細胞株和未轉染的C6細胞系，MTT法觀察順鉑對兩類腫瘤細胞的抑制率；流式細胞術檢測順鉑作用后轉染及未轉染腫瘤細胞的凋亡率；反轉錄PCR及蛋白質印跡法（Western blot）檢測轉染細胞內多藥耐藥基因（Mdr1）和拓撲異構酶TopoⅡα的mRNA水平和蛋白質水平的表達變化。結果順鉑對轉染IL18基因的膠質瘤細胞株的抑制率明顯高于未轉染細胞（P＜0.05），半數抑制濃度分別為29.66μg/ml和55.49μg/ml；流式細胞術顯示順鉑作用后的轉染細胞凋亡增多（P＜0.05）；反轉錄PCR及Western blot顯示轉染細胞的Mdr1基因表達顯著下降，TopoⅡα基因表達無明顯變化。結論轉染IL18基因能夠下調多藥耐藥基因Mdr1的表達，增強順鉑對大鼠C6膠質瘤細胞的毒作用。

關鍵詞：白細胞介素18；C6膠質瘤；多藥耐藥基因；P糖蛋白

基因治療是新興的腫瘤治療手段，其利用基因重組和轉染技術，對腫瘤細胞基因組進行改良，以期望實現治療腫瘤的目的。白細胞介素18 （Interleukin 18，IL18）是一種多功能的細胞因子，能夠增強體內抗腫瘤免疫反應［1］，是基因治療的候選基因。李文玲［2］等應用逆轉錄病毒轉染的方法構建了穩定表達具有生物活性的白細胞介素18的C6/ IL18細胞系，并在體外和體內觀察到有顯著意義的細胞生長抑制現象。不僅如此，蔣常文［3］等發現轉染IL18基因能夠顯著性下調C6細胞周期相關基因PCNA、cyclin D1、cyclin B1的表達，上調P21的表達。然而，轉染IL18基因能否下調多藥耐藥基因表達，增強化療藥物對腫瘤細胞毒性，尚未有深入的研究報道。明確轉染基因能否增強化療敏感性，將為基因治療提供更廣闊的應用前景。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

大鼠C6膠質瘤細胞和導入IL18基因的C6/ IL18細胞系，河北醫科大學細胞生物教研室制備并保存［2］。順鉑（齊魯制藥有限公司），RPMI 1640培養基（美國Gibco公司），胎牛血清（天津灝洋生物公司），四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（美國Sigma公司），Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒（美國Invitrogen公司），RT-PCR試劑盒（美國Invitrogen公司），小鼠抗大鼠βactin、Mdr1、TopoⅡα，以及辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗均來自美國Santa Cruz公司。

1.2試驗方法

1.2.1MTT檢測不同濃度順鉑對腫瘤細胞的抑制率取對數生長期C6和C6/IL18細胞，接種于96孔培養板，24 h后根據不同藥物濃度組：2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0及160.0μg/ml加入藥物，對照組加入等量的生理鹽水，每組均做3個復孔，實驗重復3次（n=9）。藥物與細胞共培養24 h后加入MTT，孵育4 h后終止反應。酶標儀（BIO-TEK ELX800，美國）在490 nm波長下測吸光值（A值）。根據公式計算細胞抑制率：對照孔A值-用藥孔A值/對照孔A值×100%。由細胞抑制率與藥物濃度的對數值作線性回歸，求出順鉑對每種細胞的半數抑制濃度（IC50）。

1.2.2流式細胞術檢測順鉑作用后的細胞凋亡率取對數生長期C6和C6/IL18細胞，接種于培養瓶中，24 h后加入終濃度為30.0μg/ml（C6/IL18細胞的IC50）的順鉑作用24 h，胰酶消化，冷PBS洗2次，Binding Buffer重懸細胞，設置陰性對照組（不加染料）、同型對照組（分別只加Annexin V-FITC和PI）以及藥物處理組（混合Annexin V-FITC和PI），室溫避光反應10 min上流式細胞儀（BD FACS Calibur，美國）檢測，調節電壓和補償，收集10 000個事件，統計門內細胞的凋亡比例。實驗重復3次。

1.2.3反轉錄PCR檢測mRNA的表達Trizol法提取細胞總RNA，并進行反轉錄反應，反轉錄產物進行PCR反應，Mdr1、TopoⅡα、βactin和IL18的退火溫度分別為51、55、53及59℃。引物見表1。

表1　擴增基因的引物序列及長度

1.2.4蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測蛋白的表達提取細胞總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度，25μg/ml孔上樣，蛋白經SDS-PAGE電泳分離后，轉至NC膜上。NC膜用一抗4℃過夜孵育（Mdr1、TopoⅡα、βactin一抗均1∶1 000稀釋），TBS洗膜，37℃二抗孵育1 h（1∶2 000稀釋），洗膜后，滴加ECL化學發光液，采用凝膠成像系統（BIO-RAD Chemi Doc XRS，美國）記錄圖像。

1.3統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，作非配對t檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2　結果

2.1順鉑對C6/IL18和C6細胞抑制率的比較

順鉑對細胞的抑制率隨濃度升高而增大（見圖1），除0.5μg/ml外，其他濃度2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0及160.0μg/ml，對C6/IL18細胞的抑制率均高于C6細胞（見表2），P＜0.05，n=9。經計算，順鉑對C6/IL18細胞的半數抑制濃度（IC50）為29.66μg/ml，明顯低于其對C6細胞的IC50 55.49μg/ml，P＜0.05。

2.2順鉑對C6/IL18和C6細胞凋亡率的比較

C6/IL18和C6細胞經順鉑作用24 h后，C6/IL18細胞凋亡率［（22.63±2.85）%，n =3］明顯高于C6細胞凋亡率［（10.57±1.93）%，n=3，P=0.012，F=1.16］。

2.3轉染IL18基因對C6細胞Mdr1和TopoⅡα基因表達的影響

反轉錄PCR和Western blot結果顯示（見圖2、3），相對于C6細胞，C6/IL18細胞的Mdr1 mRNA和蛋白表達水平均明顯減少（見表3、4），TopoⅡα變化不明顯。

圖1　順鉑對細胞的生長抑制曲線

表2　順鉑對細胞的生長抑制率（n=9，±s）

表2　順鉑對細胞的生長抑制率（n=9，±s）

注：?P＜0.05

組別順鉑濃度/（μg/ml）0.5　2.5　5.0　10.0　20.0　40.0　80.0　160.0 C6/IL18 C6 P值F值8.8±1.1　 19.2±4.7?　29.4±6.8?　40.0±10.2?　53.1±6.2?　61.5±8.0?　65.8±8.9?　69.6±6.4?9.5±1.7　 14.1±3.6　 20.6±6.8　 29.2±7.5　 40.7±11.4　 50.2±8.6　 53.5±9.5　 55.3±13.4 0.324　0.021　0.014　0.021　0.011　0.011　0.012　0.011 2.587　1.703　1.008　1.860　3.395　1.144　1.138　4.297

圖2　轉染IL18基因下調Mdr1轉錄水平

圖3　轉染IL18基因減少Mdr1蛋白表達

表3　Mdr1、TopoⅡα基因轉錄水平相對值（n=3，±s）

表3　Mdr1、TopoⅡα基因轉錄水平相對值（n=3，±s）

注：?P＜0.05

組別　C6/IL18　C6　P值　F值Mdr1　0.11±0.04?　0.55±0.05　 0.000　 2.054 TopoⅡα　 0.54±0.06　 0.47±0.03　 0.153　 5.105

表4　Mdr1、TopoⅡα基因蛋白水平相對值（n=3，±s）

表4　Mdr1、TopoⅡα基因蛋白水平相對值（n=3，±s）

注：?P＜0.05

組別　C6/IL18　C6　P值　F值Mdr1　0.10±0.05?　0.40±0.05　 0.002　 1.246 TopoⅡα　 0.21±0.04　 0.19±0.04　 0.405　 1.000

3　討論

神經膠質瘤是成人中樞神經系統中最常見的原發腫瘤，占顱內腫瘤的70%，預后差，死亡率高。膠質瘤治療采用手術、放化療結合的手段，然而患者生存時間并沒有大幅度提升和改善。主要原因是膠質瘤呈浸潤性生長，手術不能完全切除；另一方面由于其內在的耐藥性，化療藥物很難有效地殺傷腫瘤細胞，從而導致化療失敗。

化療過程中，患者在接觸化療藥物一段時間后，多數會發生耐藥，并且對其他在結構和機制上完全不同的藥物表現出交叉耐藥，這種現象稱多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）。惡性腫瘤細胞產生多藥耐藥的機制尚未完全闡明，其中已知的最重要的形成機制是P糖蛋白（Pglycoprotein，Pgp）過度表達［4］，該蛋白是跨膜轉運蛋白，定位在細胞膜和高爾基體上，可以將藥物分子泵出胞外，減少藥物的胞內累積，不僅如此，Pgp對底物要求不嚴格，可將不同類型的藥物泵出，從而形成多藥耐藥。Pgp過度表達，與腫瘤耐藥、復發和預后密切相關［5-8］。周榮福［9］等的臨床研究發現，人腦星形細胞瘤Pgp表達先天存在，對化療藥物有先天耐受性，當藥物刺激后Pgp陽性表達能產生繼發耐藥或增強先天耐藥。人類編碼這一蛋白的基因為Mdr1，定位在7號染色體長臂2區1帶，含28個外顯子。Mdr1基因啟動子及其鄰近區域，可與多條信號通路的轉錄因子結合，調節Mdr1的轉錄［4，10-12］。另一條介導多藥耐藥的途徑是DNA拓撲異構酶（Topoisomerase，Topo）的數量或活性減少［13］。真核細胞中TopoⅡ的主要作用是調節DNA空間結構，參與DNA修復、復制和轉錄。以TopoⅡ為靶點的抗腫瘤藥物通過形成藥物-酶-DNA復合物抑制DNA的復制與轉錄。研究發現［14-15］，TopoⅡ的含量或活性下調，引起藥物失去效靶，形成細胞耐藥。這類耐藥沒有Mdr1基因過表達，主要表現為TopoⅡ基因突變或缺失；TopoⅡ酶水平減少或磷酸化水平提高。

白細胞介素18是一種多功能細胞因子，能夠增強體內抗腫瘤免疫反應［1］，是基因治療的候選基因。研究表明［16］，IL18基因單獨轉染，或與其他細胞因子聯合轉染，如IL12、IFN、FASL等，表現出顯著地抑制腫瘤生長的特性。XU［16］等應用慢病毒轉染的方法，將IL18和IFNβ基因導入骨髓基質干細胞，發現這些轉基因細胞能顯著抑制膠質瘤細胞生長，促進其凋亡；大鼠模型顯示，這些轉基因細胞還能增強其他抗腫瘤因子的分泌，以及CD4+和CD8+T細胞對瘤組織的浸潤，延長荷瘤大鼠生存期。雖然轉染IL18基因能顯著地抑制腫瘤生長，但是這些研究中的腫瘤細胞并不能全部清除。轉染IL18基因能否增強化療效果尚未有深入研究。本研究首先觀察C6/IL18和C6兩種細胞，在不同濃度順鉑下的生長抑制情況，發現順鉑對C6/IL18細胞的生長抑制明顯增強。之后，進一步檢測這兩種細胞的Pgp和TopoⅡα的mRNA和蛋白水平的變化，發現C6/IL-18細胞中Pgp表達量明顯減少，這與順鉑對其有較高抑制率的結果相對應，推測轉染IL18基因通過下調多藥耐藥基因Mdr1的表達，增強藥物對C6細胞的毒作用。

Mdr1基因表達可被多條信號通路調節，其中ERK/MAPK和PI3K/AKT最密切相關。MUNOZ［17］等人的研究發現，膠質瘤細胞系對替莫唑胺耐藥的過程包含兩個階段：早期階段，胞漿內的Pgp轉運到胞膜，伴隨構象激活性改變；晚期階段，腫瘤細胞自分泌EGF，與自身的EGFR受體結合，激活ERK1/2-JNK-AP-1信號通路，增強Mdr1基因轉錄。大量研究表明［18-21］，藥物作用腫瘤細胞會引起PI3K/AKT信號活化，進而上調Mdr1表達，應用小RNA干擾或抑制PI3K-AKT活性能下調Mdr1。而PI3K/AKT下游的哪個或哪些靶基因作用Mdr1，不同課題組得出的結果不盡相同。一些研究發現抑制耐藥細胞的PI3K-AKT活性后，通過NF-κB途徑調節Mdr1［19］。而其他研究發現，藥物可通過Akt-mTOR信號通路增加Mdr1表達［20］，阻斷mTOR通路能抑制膜轉運蛋白ABCB1、ABCC1和ABCG2的表達，逆轉細胞的耐藥性［21］。這些研究使用的藥物以及腫瘤細胞類型不同，腫瘤基因組異質性較強，可能存在多個途徑影響Mdr1表達。之前的研究報道C6細胞中轉染IL18基因能夠顯著性上調P21的表達，下調周期蛋白cyclin D1和cyclin B1的表達，引起細胞周期阻滯［3］。而AKT活化介導的下游信號與這一作用相反，通過抑制P21的活性，穩定cyclin-CDK復合物，促進細胞周期進展。因此，轉染IL18基因可能通過對抗PI3K-AKT信號，調節Mdr1基因表達。

綜上所述，轉染IL18基因能夠下調Mdr1基因表達，減少細胞內Pgp蛋白水平，增強C6細胞的藥物敏感性，為IL18基因治療提供更廣闊的應用前景。

參考文獻：

［1］CHRISTOFIDES A，KOSMOPOULOS M，PIPERI C. Pathophysiological mechanisms regulated by cytokines in gliomas［J］. Cytokine，2015，71（2）：377-384.

［2］李文玲，閆蘊力，單保恩，等.逆轉錄病毒介導IL18基因在大鼠膠質瘤細胞C6中的表達［J］.細胞與分子免疫學雜志，2004，20（5）：522-525.

［3］蔣常文，閆蘊力，馬衛東，等. IL18基因轉染對大鼠C6膠質瘤細胞生長特性的影響［J］.細胞生物學雜志，2005，27（3）：339-342.

［4］AMBUDKAR S V，KIMCHI-SARFATY C，SAUNA Z E，et al. P-glycoprotein：from genomics to mechanism［J］. Oncogene，2003，22（47）：7468-7485.

［5］WU Q，YANG Z，NIE Y，et al. Multi-drug resistance in cancer chemotherapeutics：mechanisms and lab approaches［J］. Cancer Lett，2014，347（2）：159-166.

［6］ABRAHAM J，SALAMA N N，AZAB A K. The role of P-glycoprotein in drug resistance in multiple myeloma［J］. Leuk Lym-phoma，2015，56（1）：26-33.

［7］JAMROZIAK K，ROBAK T. Pharmacogenomics of MDR1/ABCB1 gene：the influence on risk and clinical outcome of haematological malignancies［J］. Hematology，2004，9（2）：91-105.

［8］HAAR C P，HEBBAR P，WALLACE GC，et al. Drug resistance in glioblastoma：a mini review［J］. Neurochem Res，2012，37（6）：1192-1200.

［9］周榮福，侯衛東，李飛，等. P糖蛋白在腦星形細胞瘤中的表達及意義［J］.中國臨床神經外科雜志，2007，12（12）：729-731.

［10］CHEN K G，SIKIC B I. Molecular pathways：regulation and therapeutic implications of multidrug resistance［J］. Clin Cancer Res，2012，18（7）：1863-1869.

［11］SUI H，FAN Z Z，LI Q. Signal transduction pathways and transcriptional mechanisms of ABCB1/P-gp-mediated multiple drug resistance in human cancer cells［J］. J Int Med Res，2012，40 （2）：426-435.

［12］ANDORFER P，ROTHENEDER H. Regulation of the Mdr1 promoter by E2F1 and EAPP［J］. FEBS Lett，2013，587（10）：1504-1509.

［13］TSURUO T，NAITO M，TOMIDA A，et al. Molecular targeting therapy of cancer：drug resistance，apoptosis and survival signal ［J］. Cancer Sci，2003，94（1）：15-21.

［14］JUN K Y，PARK S E，LIANG J L，et al. Benzo［b］tryptanthrin inhibits Mdr1，topoisomerase activity，and reverses adriamycin resistance in breast cancer cells［J］. Chem MedChem，2015，10（5）：827-835.

［15］WANG Y L，YAN Y L，ZHOU N J，et al. Mechanism of multidrug resistance of human small cell lung cancer cell line H446/VP［J］. Chin Med J，2010，123（22）：3299-3303.

［16］XU G，GUO Y，SENG Z，et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells co expressing interleukin-18 and interferon-β exhibit potent antitumor effect against intracranial glioma in rats［J］. Oncol Rep，2015，34（4）：1915-1922.

［17］MUNOZ J L，RODRIGUEZ-CRUZ V，GRECO S J，et al. Temozolomide induces the production of epidermal growth factor to regulate MDR1 expression in glioblastoma cells［J］. Mol Cancer Ther，2014，13（10）：2399-2411.

［18］XIE X，TANG B，ZHOU J，et al. Inhibition of the PI3K/Akt pathway increases the chemo-sensitivity of gastric cancer to vincristine［J］. Oncol Rep，2013，30（2）：773-782.

［19］LIN X，ZHANG X，WANG Q，et al. Perifosine downregulates MDR1 gene expression and reverses multidrug-resistant phenotype by inhibiting PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway in a human breast cancer cell line［J］. Neoplasma，2012，59（3）：248-256.

［20］WANG S F，CHOU Y C，MAZUMDE R N，et al. 7-Ketocholesterol induces P-glycoprotein through PI3K/mTOR signaling in hepatoma cells［J］. Biochem Pharmacol，2013，86（4）：548-560.

［21］ZOU Z，ZHANG J，ZHANG H，et al. 3-Methyladenine can depress drug efflux transporters via blocking the PI3K-AKT-mTOR pathway thus sensitizing MDR cancer to chemotherapy［J］. J Drug Target，2014，22（9）：839-848.

（張蕾編輯）

論著

Transfection of IL18 gene enhances cytotoxicity of cisplatin on C6 glioma cells by reducing Mdr1 expression*

Yu-hong Lyu1，Qing Chen2，Juan Zhao1，Yan-ling Wang1，Jiang-feng Zhu2，Yun-li Yan1
（1. Department of Cell Biology，Hebei Medical University，Shijiazhuang，Hebei 050017，China；2. Department of Gastroenterology，Hebei Chest Hospital，Shijiazhuang，Hebei 050041，China）

Abstract：Objective To explore the effect of transfection of interleukin 18（IL 18）on sensitivity of rat C6 glioma cells to cisplatin chemotherapy and the possible mechanism. Methods C6 cells with and without transfection of IL 18（C6/IL18 cells and C6 cells）were cultured in vitro. The growth inhibition ratios of both types of glioma cells were measured by MTT assay，when treated with cisplatin at various concentrations. Cell apoptosis was detected by flow cytometry after being treated with 50%inhibition concentration of cisplatin. The levels of mRNA and protein of Mdr1 and TopoⅡα were evaluated by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）and Western blot. Results Upon cisplatin treatment，the ratio of growth inhibition was significantly higher in the C6/IL18 cells than that in the C6 cells（P＜0.05），the 50%inhibition concentration of cisplatin was 29.66 μg/ml and 55.49 μg/ml respectively. The apoptosis ratio of the C6/IL18 cells was higher than that of the C6 cells after treatment with cisplatin（P＜0.05）. In the C6/IL18 cells，the expressions of Mdr 1 was markedly down-regulated identified by RT-PCR and Western blot，but the expressions of TopoⅡα had no significant differences. Conclusions Transfection with IL 18 significantly reduces the expressions of Mdr1，then strengthens the chemo-sensitivity of C6 glioma cells to cisplatin.

Keywords：interleukin 18；C6 glioma cell；Mdr1；Pgp

中圖分類號：R739.41

文獻標識碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1005-8982.2016.10.005

文章編號：1005-8982（2016）10-0020-05

收稿日期：2015-12-10

*基金項目：河北省醫學科學研究重點課題計劃（No：20160508）