膜聯(lián)蛋白A1和CA19-9在膽管癌中的表達(dá)及其臨床意義

李遼，王金，尚培中

（1.河北北方學(xué)院，河北張家口075000；2.解放軍第二五一醫(yī)院普通外科，河北張家口075000）

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膜聯(lián)蛋白A1和CA19-9在膽管癌中的表達(dá)及其臨床意義

李遼1，王金2，尚培中2

（1.河北北方學(xué)院，河北張家口075000；2.解放軍第二五一醫(yī)院普通外科，河北張家口075000）

摘要：目的觀察膜聯(lián)蛋白A1（Annexin A1）和腫瘤特異性大分子糖蛋白抗原CA19-9在膽管癌中的表達(dá)，探討兩者與膽管癌臨床病理特征之間的關(guān)系。方法采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)54例膽管癌術(shù)后標(biāo)本（癌組織和癌旁組織）及15例非腫瘤膽管組織中Annexin A1和CA19-9的表達(dá)，分析兩者與臨床病理特征的關(guān)系。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）分別檢測(cè)24例健康志愿者、24例膽管結(jié)石患者、24例膽管癌患者血清中Annexin A1和CA19-9的表達(dá)情況。結(jié)果膽管癌組織中Annexin A1和CA19-9表達(dá)的陽性率顯著高于癌旁組織和非腫瘤膽管組織（P＜0.05）。Annexin A1的表達(dá)狀態(tài)與膽管癌的臨床病理分期、組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），而與患者發(fā)病年齡、腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05）；CA19-9的表達(dá)與膽管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），而與患者發(fā)病年齡、腫瘤大小、臨床病理分期及組織學(xué)分級(jí)無關(guān)（P＞0.05）。Annexin A1和CA19-9在膽管癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.356，P＜0.05）。ELISA結(jié)果表明，膽管癌患者組血清中Annexin A1和CA19-9表達(dá)含量高于膽管結(jié)石患者組及健康人組（P＜0.05）。Annexin A1和CA19-9在膽管癌術(shù)前與術(shù)后血清中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論Annexin A1和CA19-9與膽管癌的發(fā)生、發(fā)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)可為膽管癌診斷及預(yù)后判斷提供一定的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：膽管癌；Annexin A1；CA19-9

膽管癌是一種起源于肝內(nèi)或肝外膽管上皮的惡性腫瘤，其發(fā)生率約占消化道腫瘤的3%，近年來全球發(fā)病率及死亡率均有所上升［1-2］。隨著影像技術(shù)的發(fā)展，臨床上對(duì)膽管癌的診斷取得長足進(jìn)步，但是在新的腫瘤標(biāo)志物研究方面仍是進(jìn)展緩慢。從分子生物學(xué)角度尋求更好、更精確的指標(biāo)是目前研究的熱點(diǎn)。Annexin A1是膜聯(lián)蛋白家族中的一員，具有鈣依賴性磷脂結(jié)合功能，參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)控、增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)行為［3］。近來研究表明，Annexin A1與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。CA19-9是一種含黏液成分的腫瘤特異性大分子糖蛋白抗原（carbohydrate antigen，CA），在膽胰惡性腫瘤的診斷中具有較高的敏感性和特異性，對(duì)于腫瘤的轉(zhuǎn)歸、復(fù)發(fā)和預(yù)后是一個(gè)有價(jià)值的指標(biāo)［4］。本研究采用免疫組織化學(xué)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）聯(lián)合檢測(cè)Annexin A1和CA19-9在膽管癌中的表達(dá)，探討Annexin A1和CA19-9與膽管的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1組織標(biāo)本

選取2010年2月-2014年1月解放軍第二五一醫(yī)院54例膽管癌手術(shù)切除后的蠟塊標(biāo)本為膽管癌組織。其中，男性34例，女性20例，男女比例1.7∶1，年齡43～82歲，平均年齡（60.370±1.249）歲。臨床及病理資料齊全，術(shù)前均未接受放療、化療及其他針對(duì)腫瘤的治療，術(shù)后病理組織學(xué)診斷均為腺癌。按世界衛(wèi)生組織分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)［5］：高分化22例、中分化24例、低分化8例。臨床分期參照美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)TNM分期2010版［6］進(jìn)行，其中Ⅰ期9例、Ⅱ期16例、Ⅲ期12例、Ⅳ期17例。選取距離腫瘤邊緣≥1 cm經(jīng)病理證實(shí)為不典型增生組織為癌旁組織。同時(shí)取15例為非腫瘤膽管組織。膽管損傷、膽管囊腫患者的膽管組織標(biāo)本。

1.2血清標(biāo)本

收集2014年8月-2015年4月間在解放軍第二五一醫(yī)院就診的膽管癌患者24例為膽管癌組，選取同期在該院就診膽管結(jié)石患者24例為膽管結(jié)石組，另外收集24例在該院體檢中心經(jīng)化驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)均正常體檢者血清為健康組。所有患者在血清標(biāo)本采集前均未行放療及化療，所有病例資料完整。

1.3試劑

鼠抗人Annexin A1免疫組織化學(xué)單克隆抗體（濃縮型），Annexin A1酶聯(lián)免疫分析試劑盒，鼠抗人CA19-9免疫組織化學(xué)單克隆抗體（即用型），CA19-9酶聯(lián)免疫分析試劑盒均系美國Cloud-Clone Corp公司；EliVisionTMplus二步法免疫組織化學(xué)染色試劑盒，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液均系福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1免疫組織化學(xué)EliVisionTMplus二步法所有組織標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，免疫組織化學(xué)染色步驟按試劑盒說明書進(jìn)行操作，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照組，以公司提供的陽性切片作陽性對(duì)照組。

1.4.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）抽取患者初診治療前1天晨起空腹靜脈血5 ml，3 500 r/min離心15 min，提取上層血清，置于-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆茫儆诨颊呤中g(shù)后第10天抽取晨起空腹靜脈血5 ml，按上述方法保存。標(biāo)本成批檢測(cè)，血清無溶血、脂濁。所有操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5結(jié)果判定

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果通過雙盲法評(píng)價(jià)，確定染色結(jié)果。Annexin A1以細(xì)胞漿或細(xì)胞膜或兩者同時(shí)出現(xiàn)棕黃色沉著為陽性信號(hào)；CA19-9以細(xì)胞漿或細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色沉著為陽性表達(dá)，根據(jù)陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度和百分?jǐn)?shù)進(jìn)行分析，依據(jù)陽性細(xì)胞顯色程度計(jì)分：無顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。依據(jù)顯色細(xì)胞陽性百分比計(jì)分：高倍視野下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總計(jì)數(shù)百分比，無或陽性細(xì)胞＜10%記為0分，10%～25%記為1分，25%～50%記為2分，＞75%記為3分。將兩個(gè)分值相加，0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～5分為陽性（++），5分以上為強(qiáng)陽性（+++）。

ELISA試驗(yàn)使用北京普朗公司生產(chǎn)的DNM-9602標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇擬合系數(shù)（即“r”值）最好的曲線方程對(duì)測(cè)得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，ELISA試驗(yàn)中多組計(jì)量資料用方差分析，術(shù)前與術(shù)后比較用配對(duì)t檢驗(yàn)，免疫組織化學(xué)中Annexin A1和CA19-9的表達(dá)及其與膽管癌臨床病理特征分析用X2檢驗(yàn)，Spearman相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Annexin A1和CA19-9在膽管癌不同組織中的表達(dá)

在膽管癌、膽管癌旁和非腫瘤膽管3種不同組織中，Annexin A1的陽性表達(dá)率分別為70.37%（38/ 54），33.33%（18/54），6.67%（1/15），各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X2=25.709，P＜0.05）；CA19-9的陽性表達(dá)率分別為74.07%（40/54），38.89%（21/54），13.33%（2/15），各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X2= 23.192，P＜0.05）。見圖1、2和表1。

圖1　Annexin A1在膽管組織中的表達(dá)（EliVisionTMplus×100）

圖2　CA19-9在膽管組織中的表達(dá)（EliVisionTMplus×100）

2.2Annexin A1和CA19-9的表達(dá)水平與膽管癌患者臨床病理特征關(guān)系

54例膽管癌患者中，Annexin A1的表達(dá)與腫瘤的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），而與患者年齡、腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05）；CA19-9的表達(dá)則與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），而與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤的分化程度、TNM分期無關(guān)（P＞0.05）。見表2。

2.3膽管癌中Annexin A1和CA19-9表達(dá)之間的關(guān)系

38例Annexin A1陽性表達(dá)的膽管癌組織中，同時(shí)有CA19-9陽性表達(dá)32例，共陽率為59.26%，在16例Annexin A1陰性表達(dá)的標(biāo)本中，同時(shí)有CA19-9陰性表達(dá)8例，共陰率為14.81%。經(jīng)Spearman相關(guān)分析，Annexin A1和CA19-9在膽管癌中的表達(dá)呈正相關(guān)，兩者相關(guān)系數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.356，P=0.008＜0.05）。見表3。

2.43組血清標(biāo)本中AnnexinA1和CA19-9的含量

膽管癌組血清Annexin A1、CA19-9表達(dá)水平明顯高于膽管結(jié)石組及健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Annexin A1：F =68.525，P =0.000；CA19-9：F =135.333，P=0.000）；在膽管結(jié)石組血清中Annexin A1的表達(dá)水平略高于健康組，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.660）；CA19-9在膽管結(jié)石患者血清中的表達(dá)水平高于健康組，但兩者差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.731）。見表4。

2.5膽管癌組手術(shù)前后血清中Annexin A1和CA19-9的含量

膽管癌組患者手術(shù)前血清中Annexin A1和CA19-9的含量均高于手術(shù)后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表1　Annexin A1和CA19-9在不同膽管組織中的表達(dá)　例（%）

表2　膽管癌組織中Annexin A1、CA19-9表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系　例（%）

表3　Annexin A1和CA19-9在膽管癌中表達(dá)的關(guān)系　例

表4　3組血清中Annexin A1、CA19-9的含量（n=24，±s）

表4　3組血清中Annexin A1、CA19-9的含量（n=24，±s）

組別　Annexin A1/（ng/ml）　CA19-9/（u/ml）膽管癌組　6.314±2.957　21.558±8.250膽管結(jié)石組　1.328±0.444　2.088±0.711健康組　1.105±0.416　1.610±0.584

表5　膽管癌患者手術(shù)前后Annexin A1、CA19-9的含量（n=24，±s）

表5　膽管癌患者手術(shù)前后Annexin A1、CA19-9的含量（n=24，±s）

組別　Annexin A1/（ng/ml）　CA19-9/（u/ml）術(shù)前　6.314±2.957　21.558±8.250術(shù)后t值P值5.389±2.025 3.199 0.004 12.131±0.886 9.543 0.000

3　討論

膽管癌的發(fā)生、發(fā)展建立在機(jī)體本身遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的基礎(chǔ)上，是一個(gè)多階段、多基因協(xié)同參與的過程。Annexin A1是一類鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，其N-末端含有多個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，具有調(diào)控Annexin A1與其他蛋白相互作用的功能，能夠與表皮生長因子受體結(jié)合，通過MAPK/ ERK信號(hào)通路影響蛋白質(zhì)復(fù)合物形成和活性，抑制細(xì)胞周期D1期表達(dá)，減少細(xì)胞增殖［7-9］。Annexin A1的異常表達(dá)可造成細(xì)胞生長紊亂，從而影響腫瘤的發(fā)生，而其在多種惡性腫瘤組織中也存在不同的表達(dá)［10-11］。Annexin A1在胃食管交界處腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌中表達(dá)增強(qiáng)，在鼻咽癌、頭頸部鱗癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌中表達(dá)降低，該表達(dá)水平迥異未發(fā)現(xiàn)明顯規(guī)律，依目前的研究統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，其在鱗狀細(xì)胞癌中多表達(dá)降低，而在腺癌組織中表達(dá)多呈升高趨勢(shì)。本研究中采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Annexin A1主要表達(dá)于膽管癌細(xì)胞的胞漿和胞膜中，并且在癌組織中陽性表達(dá)率明顯高于癌旁不典型增生組織和非腫瘤膽管組織。在Annexin A1與膽管癌的臨床病理特征之間的關(guān)系中，筆者發(fā)現(xiàn)，臨床TNM分期越晚的病理Annexin A1陽性率越高；病理分化越低的組織中，Annexin A1表達(dá)越高；在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，Annexin A1表達(dá)高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。提示Annexin A1在正常膽管組織中有一定的生理作用，而且參與正常膽管上皮到惡性腫瘤的演變過程。

CA19-9是一種糖鏈抗原，由單克隆抗體116NS 19-9識(shí)別，在血清中表達(dá)為黏蛋白糖脂，在組織中表達(dá)為單涎酸神經(jīng)節(jié)糖苷脂［12］?？煞植荚谡Ｈ说囊认?、膽管上皮等處，是目前臨床上用于診斷膽管癌、胰腺癌最重要的指標(biāo)，敏感性高［13］。在本研究中發(fā)現(xiàn)，膽管癌組織中CA19-9的表達(dá)水平由非腫瘤膽管組織、癌旁組織到膽管癌組織呈增強(qiáng)趨勢(shì)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膽管癌組織中CA19-9表達(dá)低于伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示CA19-9與膽管癌的發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

此外，筆者在對(duì)3組不同血清檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，膽管癌組中Annexin A1、CA19-9的表達(dá)均明顯高于膽管結(jié)石組和健康組，再次驗(yàn)證兩者在膽管癌的發(fā)生和發(fā)展中起著一定作用。楊盡暉等報(bào)道中［14］，CA19-9作為膽管癌診斷的一個(gè)重要指標(biāo)，血清中的敏感性為79%，特異性為89%，且在行手術(shù)切除后，患者血清中CA19-9明顯下降。而目前關(guān)于Annexin A1在血清含量及其降解的研究較少。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Annexin A1在膽管癌組術(shù)前中的表達(dá)高于術(shù)后。由此筆者推測(cè)兩者可作為膽管癌、手術(shù)診斷、手術(shù)效果判定及腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的輔助指標(biāo)。

綜上所述，筆者通過免疫組織化學(xué)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Annexin A1在膽管癌中的高表達(dá)提示其可能成為腫瘤治療的一個(gè)新的干預(yù)靶點(diǎn)，調(diào)控其表達(dá)或其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［15］，并由此發(fā)現(xiàn)治療膽管癌的新藥物。聯(lián)合檢測(cè)Annexin A1和CA19-9的表達(dá)，可為膽管癌診斷及預(yù)后評(píng)估提供參考依據(jù)。

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（張蕾編輯）

論著

Expressions of Annexin A1 and CA19-9 in cholangiocarcinoma and their clinicopathological significance

Liao Li1，Jin Wang2，Pei-zhong Shang2
（1. Hebei North University，Zhangjiakou，Hebei 075000，China；2. Department of General Surgery，the 251st Hospital of PLA，Zhangjiakou，Hebei 075000，China）

Abstract：Objective To investigate the expressions of Annexin A1 and CA19-9 in cholangiocarcinoma and their correlations with clinical and pathological features. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expressions of Annexin A1 and CA19-9 in 54 samples of cholangiocarcinoma and the surrounding tissues and 15 samples of non-carcinoma bile duct tissue. Statistical analysis was performed with reference to the related clinical and pathological features. Enzyme -linked immunosorbent assay（ELISA）was used to detect the expressions of Annexin A1 and CA19-9 in the serum of 24 healthy volunteers，24 patients with bile duct stones and 24 cases of bile duct carcinoma. Results The positive expression rates of Annexin A1 and CA19-9 in the cholangiocarcinoma were significantly higher than those in the peri-carcinoma tissue and non-carcinoma bile duct tissue（P＜0.05）. The positive expression of Annexin A1 was correlated with the pathological grades，clinical stages and lymph node metastasis of cholangiocarcinoma（P＜0.05）. The positive expression of CA19-9 was correlated with the lymph node metastasis of cholangiocarcinoma（P＜0.05）. The expression of Annexin A1 in the cholangiocarcinoma was positivelybook=32,ebook=37correlated with that of CA19-9（r = 0.356，P＜0.05）. The results of ELISA indicated that the expressions of Annexin A1 and CA19-9 in serum of the cholangiocarcinoma patients were significantly higher than those in the patients with bile duct stones and the healthy volunteers（P＜0.05）. In the cholangiocarcinoma patients，the expressions of Annexin A1 and CA19-9 before operation had significant differences from those after operation（P＜0.05）. Conclusions The positive expressions of Annexin A1 and CA19-9 may be correlated with carcinogenesis，development and lymph node metastasis of cholangiocarcinoma. The combined detection of the above markers possibly has certain referential value in diagnosis of cholangiocarcinoma and its prognosis.

Keywords：cholangiocarcinoma；Annexin A1；CA19-9

中圖分類號(hào)：R735.8

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1005-8982.2016.10.007

文章編號(hào)：1005-8982（2016）10-0031-05

收稿日期：2015-12-02

［通信作者］尚培中，E-mail：spz251@163.com；Tel：18903138087