成纖維細胞生長因子受體2基因rs1219648位點多態性與青海回族女性乳腺癌易感性的關聯研究*

沈國雙，鄭方超，趙久達

（青海大學附屬醫院乳腺甲狀腺外科，青海西寧810016）

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成纖維細胞生長因子受體2基因rs1219648位點多態性與青海回族女性乳腺癌易感性的關聯研究*

沈國雙，鄭方超，趙久達

（青海大學附屬醫院乳腺甲狀腺外科，青海西寧810016）

摘要：目的探究成纖維細胞生長因子受體2（FGFR2）基因rs1219648位點單核苷酸多態性（SNP）與青海地區回族女性乳腺癌易感性的關系。方法采用病例對照研究，利用TaqMan-MGB探針法對青海地區110例回族女性乳腺癌病例和110例正常回族女性對照進行FGFR2基因rs1219648位點基因型檢測，利用多元Logistic回歸分析該位點不同基因型與乳腺癌易感性之間的關系。結果FGFR2基因rs1219648位點基因型頻率在病例組和對照組之間的差異具有統計學意義（P=0.001）。FGFR2基因rs1219648位點A＞G改變可以顯著的增加青海地區回族女性人群乳腺癌易感性。其中，在校正初潮年齡、是否絕經、乳腺良性疾病史和乳腺癌家族史因素后，該位點A＞G的改變仍可以顯著增加該地區回族女性人群乳腺癌患病風險（O∧RAG-GG/AA= 2.37，95%CI：1.18，4.73）。結論FGFR2基因rs1219648位點A＞G改變可顯著增加青海地區回族女性乳腺癌的患病風險，預期可以作為該地區女性乳腺癌易感性的重要生物標志物。

關鍵詞：FGFR2基因；乳腺癌；回族；單核苷酸多態性；生物標志物

乳腺癌是我國最主要的惡性腫瘤之一，其發病率高居城鄉女性首位，是危害居民生命健康的主要惡性腫瘤之一，且我國居民乳腺癌的發病率在近十幾年總體呈上升趨勢［1］。2004～2005年第3次全國全死因調查結果顯示，青海省乳腺癌的粗死亡率為全國平均水平，但惡性腫瘤粗死亡率高居全國第3位［2］。因此，針對該地區女性乳腺癌開展相關研究顯得勢在必行。近年來的研究發現，成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptors，FGFRs）家族在腫瘤發生過程中起到舉足輕重的作用［3］。其中，成纖維細胞生長因子受體2（fibroblast growth factor receptors 2，FGFR2）被發現在乳腺癌的組織和細胞系中存在過表達現象，而且越來越多的研究證實了FGFR2基因過表達與乳腺癌發病之間的關聯［4-6］。目前關于FGFR2基因rs1319648位點多態性與乳腺癌之間的關聯已在貴州地區漢族人群［7］和寧夏地區漢族人群［8］中得到證實。此外，本研究團隊早期利用青海地區60例回族女性乳腺癌患者和60例健康回族女性對照，初步探究FGFR2基因多態性與該地區回族女性乳腺癌患病易感性之間的關聯，結果發現：攜帶有FGFR2基因rs2420946位點C＞T多態性改變的回族女性其乳腺癌的患病風險增加0.7倍［9］。考慮到不同種族人群遺傳背景對乳腺癌易感性的影響不同，本研究利用病例對照研究進一步分析FGFR2基因rs1219648位點單核苷酸多態性與青海地區回族女性人群乳腺癌易感性之間的關聯，以期為該地區女性乳腺癌的早期篩查及靶向治療提供參考依據。

1　資料與方法

1.1研究對象

收集2008年6月-2011年6月在青海大學附屬醫院進行治療且無血緣關系的110名女性乳腺癌患者作為病例組。均為久居青海地區的回族女性，所有的患者都經過組織病理學確診，且術前未進行新輔助放射治療和抗腫瘤藥物治療，平均年齡為（48.75±9.84）歲。選取本院常規體檢110名正常女性作為對照組，均為久居青海地區的回族女性，且無腫瘤病史。

所有受試對象在簽署知情同意書后，由經過統一培訓的調查員、使用統一印制的調查表對每個研究對象進行面訪調查或從病歷中摘錄，收集一般人口學資料、月經生育史、乳腺良性疾病史和乳腺癌家族史等信息，并采集5 ml外周血液標本。病例組患者的組織病理學標本收集后立即置于液氮中迅速冷凍，然后移至-70℃冰箱保存。

1.2試劑

全血DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、Taq-Man通用PCR擴增預混試劑、無核酸水、PCR引物序列和TaqMan-MGB探針序列（均為天跟生化科技有限公司提供）。

1.3儀器與設備

離心機（低溫高速離心機、臺式高速離心機和常溫高速離心機）和7900實時定量PCR儀及配套分析軟件（美國ABI公司）及水浴鍋等。

1.4試驗方法

1.4.1外周血DNA提取所有血樣EDTA-K2抗凝，分裝后置程序降溫，最終置于-80℃冰箱內保存。采用全血DNA提取試劑盒按使用說明提取并純化全血基因組DNA。

1.4.2TaqMan-MGB探針PCR法對FGFR2基因rs1219648位點進行基因型分型根據NCBI數據庫報道人類FGFR2基因DNA序列，利用Primer Premier5軟件設計rs1219648位點PCR引物序列為：S5'-CACGCCTATTTTACTTGACACGC-3'；A 5'-TTTC CTCACTGTGATTTGTATGTGG-3'。Probe 1‘FAM-TT ACTTGACACACaCTC-MGB’；TaqMan-MGB探針Probe2 ‘HEX-TTACTTGACAgCTC-MGB’。反應總體系為5μl，含待測樣品DNA 1μl，PCR擴增預混試劑2.5μl，PCR引物0.2μl，TaqMan-MGB探針0.1μl，無核酸水1.2μl。瞬時離心2s后，放入7900HT定量PCR儀進行擴增。PCR擴增條件為TaqDNA聚合酶在95℃下活化10 min，按92℃變性15 s，60℃退火/延伸30 s，共進行40個循環。利用7900HT定量PCR配套分析軟件對擴增結果進行分析。考慮到DNA試劑盒提取DNA數量、質量和TaqMan探針進行基因分型的準確性等因素，所有標本分型完成后，隨機抽取5%的標本進行DNA測序驗證。

1.5統計學方法

采用SAS 9.1.3統計軟件進行數據分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，采用擬合優度X2檢驗對正常對照組受試者基因型分布進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。利用t檢驗或X2檢驗比較兩組受試者一般人口學特征、乳腺良性疾病史、乳腺癌家族史和FGFR2 rs1219648基因型分布之間的差異。比值比（odds ratio，OR）及95%可信區間（confidence intervals，CIs）則通過單因素和多因素Logistic回歸模型進行估計，用來表示相對風險度，并對初潮年齡、絕經年齡、乳腺良性疾病史和乳腺癌家族史進行校正。所有的檢驗均為雙側檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1一般資料信息的比較分析

110例病例組和110名正常對照組的平均年齡（47.15±9.47）vs（48.75±9.84）、生育年齡（＞30歲，13.64%vs 10.91%）、體重指數（＞24 kg/m2，11.82% vs 10.91%）、生育次數（＞2次，19.09%vs 21.82%）和是否具有母乳喂養史（有，90.91%vs 82.73%）間的分布差異均無統計學意義。與正常對照組比較，病例組初潮年齡（≤13歲，30.00%vs 11.82%）、是否絕經（60.91%vs 80.91%）、乳腺良性疾病史陽性（65.45%vs 27.27%）和乳腺癌家族史陽性（66.36%vs 36.36%）的比例均顯著性升高。見表1。

表1　患者一般資料信息比較　例（%）

2.2利用TaqMan-MGB法和DNA測序法進行FGFR2基因rs1219648位點基因分型的結果

TaqMan-MGB探針法對FGFR2基因rs1219648位點基因型的分型結果和DNA測序結果詳見圖1。其中，圖1為TaqMan-MGB探針法的分型結果，圖中橫坐標為HEX信號強度、縱坐標為FAM信號強度、紅色點為GG基因型、綠色點為AG基因型、藍色點為AA基因型、NTC為No Template Control。圖2、圖3和圖4分別為DNA測序結果，其中圖2為AA基因型、圖3為AG基因型、圖4為GG基因型。

圖1　TaqMan-MGB探針基因分型結果

2.3FGFR2基因rs1219648位點單核苷酸多態性與青海地區乳腺癌易感性之間的關聯研究

在110例正常對照人群中，FGFR2基因rs1219648位點等位基因頻率為0.3545，且該位點基因型在對照組人群中的分布符合Handy-Weinberg平衡（P=0.346），提示對照組具有良好的代表性。

FGFR2基因rs1219648位點基因型分布及其與青海回族女性乳腺癌患病易感性之間的關系，詳見表2。如表2所示，該位點基因型頻率分布在對照組和病例組之間的差異具有統計學意義（P＜0.001）。單因素Logistic回歸分析結果顯示，伴有AG、GG或AG-GG基因型的女性相對于伴有AA基因型的女性，乳腺癌的患病風險分別增加了2.34倍（OR∧AG/AA=3.34，95%CI：1.78，6.28）、1.88倍（OR∧GG/AA= 2.88，95%CI：1.28，6.47）和2.21倍（O∧RAG-GG/AA= 3.21，95%CI：1.76，5.85）。多因素Logistic回歸分析在調整初潮年齡（＞13歲）、是否絕經、乳腺良性疾病史和乳腺癌家族史后，發現FGFR2 rs1219648位點A＞G的突變（AG-GG/AA）仍可以增加青海地區女性乳腺癌的患病風險（O∧RAG-GG/AA=2.37，95%CI：1.18，4.73），提示FGFR2基因rs1219648位點A＞G的改變可能是該地區女性人群乳腺癌患病易感性的遺傳因子。

進一步進行分層分析，分別以初潮年齡（＞13歲）、是否絕經、乳腺良性疾病史和乳腺癌家族史為分層因素，利用多元Logistic回歸模型對FGFR基因rs1219648位點基因型多態性與青海地區回族女性乳腺癌患病風險進行分析，發現在初潮年齡（＞13

歲，OR∧

AG-GG/AA=2.62，95%CI：1.19，3.76）、絕經前（OR∧

AG-GG/AA=6.99，95%CI：1.75，39.00）、乳腺良性疾病史陰性（OR∧AG-GG/AA=3.55，95%CI：1.31，9.65）和乳腺癌家族史陰性（OR∧AG-GG/AA= 5.62，95%CI：1.81，17.48）的女性人群中，A＞G突變，即AG和GG基因型可以更加顯著的增加乳腺癌的患病易感性。

圖2　AA基因型的測序結果

圖3　AG基因型的測序結果

圖4　GG基因型的測序結果

表2　FGFR2基因rs1219648基因型分布與青海地區回族女性乳腺癌患病風險　例（%）

表3　FGFR2基因rs1219648基因型分布與青海地區回族女性乳腺癌患病風險的分層分析

3　討論

FGFR2是FGFRs家族的重要成員，位于10號染色體長臂2區6帶（10q26），與大多數的受體酪氨酸蛋白激酶（receptor tyrosine kinases，RTKs）整體結構相似，屬于單跨膜蛋白，在細胞增殖、黏附、遷移和侵襲以及血管增生過程中發揮重要作用［3，10］。FGFR2基因多態性與乳腺癌發病之間的關聯早在2007年由EASTON等［11］在進行全基因組關聯研究分析時得到確認。隨后，HUNTER等［12］在對高加索人群進行全基因關聯分析中進一步證實了FGFR2基因rs1219648位點多態性與絕經后女性乳腺癌發病之間的關聯性。ANDERSEN等［13］通過對1 677例美國女性進行分析后，也證實了FGFR2基因rs1219648位點A＞G的改變可能增加乳腺癌的患病風險。在中國，張敬平等［5］通過對1 460例大樣本人群的研究進一步證實FGFR2基因rs1219648位點單核苷酸多態性與漢族人群乳腺癌易感性存在關聯。然而，LIANG等［14］通過對1 049名乳腺癌患者和1 073名正常人群進行FGFR2基因多態性與乳腺癌發病易感性的病例對照研究，結果發現伴有FGFR2基因多個位點（rs2981582、rs1219648和rs2420946）同時改變的女性，乳腺癌的發病風險顯著性增加，單個位點突變效應則不明顯。此外，RASKIN等［15］對3 057名猶太人進行FGFR2基因多態性與乳腺癌發病風險之間的關聯研究，發現不同族系猶太人群FGFR2基因多態性與乳腺癌的關聯程度不同。

本研究在青海地區回族女性人群中，采用病例對照研究探討FGFR2基因rs1219648位點單核苷酸多態性與乳腺癌易感性之間的關系。結果顯示，FGFR2基因rs1219648位點A＞G的改變可以顯著地增加乳腺癌的患病風險（OR∧AG-GG/AA=2.43，95% CI：1.12，5.28），這種現象在初潮年齡（＞13歲）、絕經前、乳腺良性疾病史陰性和乳腺癌家族史陰性的女性中尤為明顯。這一研究結果與EASTON、HUNTER和張敬平等的研究結果一致，但與LIANG和RASKIN等的結果不同，分析其原因可能為：①研究對象選擇的局限性。本研究110例乳腺癌患者全部來自于青海大學附屬醫院住院人群，而正常對照則來自于健康體檢人群，這使得研究對象的代表性有限，存在選擇性偏倚。②FGFR2基因多態性與腫瘤的關聯可能與種族有關［15］。本研究的研究對象均為久居青海地區回族女性人群，其獨特的遺傳背景和生活環境可能影響腫瘤的發生發展。③本研究的樣本量偏小。這主要與青海地區回族人群數量偏小有關。

此外，本研究結果還發現，在絕經前女性人群中，FGFR基因rs1219648位點A＞G的突變與乳腺癌易感性的關聯更為顯著，分別為OR∧AG/AA=6.04 （95%CI：1.04，35.29）、OR∧CC/AA=13.80（95%CI：1.26，150.89）和OR∧AG-GG/AA=6.99（95%CI：1.25，39.00），而這一結果與ANDERSEN等［13］的研究結果不一致。造成這一結果的主要原因可能是由于本研究樣本量比較小（n=220），且絕經前期女性所占比例較小（29.91%），導致分層分析結果不穩定，進而掩蓋了該位點多態性與乳腺癌患病易感性之間的真實關聯。擴充樣本量，均衡絕經前后受試者比例，有助于深入研究FGFR基因rs1219648位點A＞G突變對乳腺癌患病易感性的影響。

但是，值得注意的是，本研究進一步在青海地區回族女性人群中證實了FGFR2基因rs1219648位點A＞G的改變能夠顯著地增加該地區女性乳腺癌的患病易感性，提示該位點基因型的多態性可能是改變該地區女性乳腺癌患病易感性的遺傳因子。此外，由于不同地域人群生活環境和遺傳背景存在差異，大樣本的深入研究仍需在該地區進一步開展。

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（張蕾編輯）

論著

Single nucleotide polymorphism of FGFR2 gene rs1219648 and susceptibility of breast cancer in female Muslim population of Qinghai province*

Guo-shuang Shen，Fang-chao Zheng，Jiu-da Zhao
（Department of Breast and Thyroid Surgery，the Affiliated Hospital，Qinghai University，Xining，Qinghai 810016，China）

Abstract：Objective To explore the association between single nucleotide polymorphism（SNP）of fibroblast growth factor receptors 2（FGFR2）gene rs1219648 and susceptibility of breast cancer in female Muslim population of Qinghai province. Methods Using case-control study，the genotypes of FGFR2 gene rs1219648 were detected by denaturing high performance liquid chromatography（dHPLC）among 110 breast cancer cases and 110 healthy controls. Multivariable logistic regression models were performed to estimate the odds ratios and 95%confidence intervals. Results There was a statistically significant difference in genotype frequencies of FGFR2 gene rs1219648 between the cases and the controls（P = 0.001）. The mutation from A to G of FGFR2 gene rs1219648 was significantly associated with an increased susceptibility of breast cancer among female Muslim population in Qinghai province；this still existed after additional adjustment for age at first menstruation（＞13 years of age），menopausal status，history of benign breast diseases and family history of breast cancer（O∧RAG-GG/AA= 2.37，95%CI∶1.18，4.73）. In stratified analyses，this effect was more evident among Muslim population with age of first menstruation older than 13，premenopause，no history of benign breast diseases and no family history of breast cancer. Conclusions These findings suggest that the single nucleotide polymorphism of FGFR2 gene rs1219648 may contribute to the susceptibility ofbook=46,ebook=51breast cancer among female Muslim population in Qinghai province，and it might be also served as a potential biomarker for diagnosis of breast cancer.

Keywords：FGFR2 gene；breast cancer；Muslim；SNP；biomarker

中圖分類號：R737.9

文獻標識碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1005-8982.2016.10.010

文章編號：1005-8982（2016）10-0045-06

收稿日期：2015-12-24

*基金項目：教育部春暉計劃項目（No：Z20100063）

［通信作者］趙久達，E-mail：13109708777@163.com