小鼠胰島β細胞(Min6)長鏈非編碼RNA Meg3綁定PRC2沉默Hes1表達

胡艷妹，朱亞男，德　偉

?

·基礎醫學·

小鼠胰島β細胞(Min6)長鏈非編碼RNA Meg3綁定PRC2沉默Hes1表達

胡艷妹1，朱亞男2，德偉2

摘要：目的細胞水平研究Meg3與PRC2復合物的關系以及對其下游基因的影響。方法實時定量 PCR 檢測Meg3在Min6細胞細胞核和細胞質的定位，采用RIP技術、UCSC Genome Browser、CHIP技術驗證Meg3與Ezh2及其下游基因Hes1的關系。結果qRT-PCR檢測Min6中轉染Si-Ezh2、Si-Suz12后Hes1基因的表達顯著受到抑制，CHIP結果表明Ezh2能直接綁定在Hes1的啟動子區域并介導H3K27me3的修飾過程，而敲除Meg3和Ezh2的表達使Ezh2與H3k27的結合能力降低。結論 lncRNAMeg3在小鼠胰島Min6細胞中能夠綁定核心蛋白復合體PRC2，Ezh2可以直接調控下游轉錄因子基因Hes1的表達，該發現可以進一步豐富和完善胰島功能的基因調控網絡。

關鍵詞：長鏈非編碼RNA；胰島β細胞；Meg3； PRC2；Hes1表達

2.南京醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學實驗室，江蘇南京 210029

長鏈非編碼RNA(lncRNA)的研究在國內外已成為熱點，但研究主要都集中在腫瘤方面，胰島細胞功能方面的研究很少。長鏈非編碼RNA小鼠母系表達3(lncRNAMeg3)位于12號染色體末端，屬于母源性印跡基因，和人源Meg3基因具有同源性[1-2]。

Polycomb group (PcG) 蛋白是一組通過染色質修飾調控靶基因的轉錄抑制子，從生化和功能上分成兩個主要的核心蛋白復合體PRC1(polycomb repressive complex 1)和PRC2(polycomb repressive complex 2) ，PRC1維持處于阻抑狀態染色質的穩定性，PRC2在轉錄抑制起始階段發揮作用[3-5]。PRC2由Ezh2、Suz12、Ezh1、Eed等多種亞基組成。最近研究發現，在小鼠的胚胎干細胞中，Meg3可以通過綁定PRC2亞基Ezh2，進而調控下游靶基因[6]。本文擬通過體外細胞實驗、RIP技術及CHIP技術，研究小鼠成年胰島細胞系Min6細胞中Meg3與PRC2復合物的關系以及對下游基因的影響。

1材料與方法

1.1細胞系小鼠成年胰島細胞系Min6細胞，由南京醫科大學生物化學與分子生物學實驗室保存。

1.2主要儀器及試劑實驗所需DMEM高糖培養基、0.25%胰蛋白酶(0.02%EDTA)，胎牛血清購自加拿大Gibco公司；Meg3、Ezh2抑制劑購自美國Invitrogen公司；RIP、CHIP試劑盒購自美國Millipore公司)。Megafuge 1.0R高速離心機來自美國Sigma Aldrich公司，實時定量 PCR 擴增儀、低溫高速離心機購自德國 Eppendorf 公司。

1.3主要方法

1.3.1細胞常規培養Min6細胞用高糖DMEM培養，15%FBS，2.5 mmol·L-1beta-巰基乙醇，100 U·mL-1青霉素，以及100 mg·L-1鏈霉素培養基于37 ℃、含5% CO2的恒溫培養箱中常規培養。

1.3.2核質分離預冷PBS洗滌2次Min6細胞后進行胰酶消化，將細胞裝入2 mL無菌無酶管，4 ℃胰酶消化5 min，棄上清用1 mL PBS洗滌沉淀，棄上清，加入500 μL細胞分離試劑，輕輕吹打，冰上靜置5～10 min。上清(質)轉入新2 mL無菌無酶管，4 ℃靜置5 min。 沉淀(核)加入500 μL細胞分離試劑，輕彈混勻，加入500 μL細胞溶解/綁定試劑，輕輕吹打混勻，冰上靜置，棄上清，加入預冷500 μL細胞分裂試劑，立即劇烈渦旋混勻后加入500 μL無水乙醇，輕輕吹打混勻，將吸附柱放入收集管，每次加入700 μL反應液，12 000 g離心30 s。向沉淀加入700 μL清洗液，12 000 g離心30 s，棄收集管加入500 μL清洗液2/3，12 000 g離心30 s，棄收集管最大轉速離心空柱1 min，棄收集管。吸附柱換上新收集管，加入 40 μL稀釋溶液(提前水浴到 95 ℃)12 000 g離心 30 s 洗脫后加入10 μL洗脫液洗脫。測定RNA 濃度，DNA 逆轉錄，qPCR。

1.3.3Meg3和Ezh2抑制劑的瞬時轉染Min6細胞按每孔1×106個細胞接種于6孔培養板，待細胞貼壁后，細胞融合度達70%～80%用于轉染。取10 μL 脂質體稀釋于250 μL的OPTI-MEMI中，溫和吹打混勻，室溫下孵育5 min。取100 pmol si-Meg3或si-Ezh2、si-NC稀釋于250 μL OPTI-MEMI中，吹打混勻。將孵育好的脂質體與si-Meg3或si-Ezh2、si-NC稀釋液混合，溫和吹打混勻。于室溫下繼續孵育20 min。將上述混合物均勻滴入事先加好1.5 mL OPTI-MEMI的6孔培養板中，輕輕混勻。37 ℃，5% CO2培養箱中繼續培養，轉染6 h后，換完全培養基。

1.3.4RNA免疫沉淀法(RIP技術)RIP實驗按照美國密理博公司RNA免疫沉淀試劑盒的說明書進行操作。

1.3.5染色質免疫沉淀(CHIP技術)首先用1%甲醛處理Min6細胞使其蛋白質與DNA交聯，超聲波將細胞染色質打斷成200～500 bp的片斷；通過抗甲基組蛋白H3和Ezh2抗體沉淀蛋白質-DNA交聯復合體；用蛋白酶K處理解除交聯，純化DNA；實時定量PCR檢測DNA的量。

2結果

2.1Meg3與Ezh2的綁定利用核質分離試劑盒對Min6細胞進行核質分離，實時定量PCR檢測Meg3在Min6細胞的細胞核和細胞質的定位。結果如圖所示(圖1A)：Meg3主要定位在Min6細胞的細胞核中，提示Meg3可能在轉錄水平調控基因表達。RIP結果顯示(圖1B)Min6細胞中Meg3可以綁定Ezh2。

A：Meg3在Min6中的細胞定位；B：Min6細胞系中Meg3可以綁定Ezh2。①與Ig G相比，P<0.05。

圖1Min6細胞系中Meg3可以綁定Ezh2

2.2Ezh2與下游基因Hes1綁定為驗證Min6細胞中Meg3可以募集PRC2復合物的亞基Ezh2并綁定Ezh2，從而調控Ezh2下游轉錄抑制因子Hes1的表達，本文采用UCSC Genome Browser發現H3K27me3在Hes1啟動子區域出現峰值(圖2)。

圖2　H3K27me3在Hes1啟動子區域出現峰值

2.3Meg3綁定PRC2沉默Hes1基因的表達本研究中qRT-PCR檢測Min6中轉染si-Ezh2，si-Suz12后Hes1基因的表達顯著受到抑制(P<0.05，圖3A)，CHIP結果表明Ezh2能直接綁定在Hes1的啟動子區域并介導H3K27me3的修飾過程，而敲除Meg3和Ezh2的表達使Ezh2與H3K27的結合能力降低(圖3B、C)。

A：qRT-PCR檢測Min6中轉染si-Ezh2,si-Suz12后Hes1的表達；B、C：CHIP檢測Min6中轉染si-Ezh2,si-Suz12后Hes1的表達。①P<0.05。

圖3Min6細胞系Meg3綁定PRC2沉默Hes1基因的表達

3討論

胰島β細胞是機體內唯一能合成和分泌胰島素的細胞，在機體維持血糖平衡方面起著重要的作用[11]，糖尿病則為因體內胰島素分泌絕對或者相對不足所導致的一系列臨床綜合征。研究表明，約30%的lncRNAs只在細胞核中被發現，約15%只在細胞質中被發現，而約50%定位在細胞核和細胞質中[7]。這樣的亞細胞分布表明lncRNAs參與轉錄和轉錄后水平的基因調控。據文獻報道，大約20%lncRNAs在各種生命進程中能夠通過結合PRC2表觀調控基因的表達。PRC2復合物是一種甲基轉移酶，是由 Ezh2和Suz12組成。PRC2中核心亞基Ezh2具有組蛋白甲基轉移酶的活性，優先選擇組蛋白3賴氨酸27位點三甲基化(Histone3 Lysine 27 trimethylation，H3K27me3)修飾，進而導致基因的轉錄失活。根據生物信息學軟件分析預測Meg3與Ezh2存在結合。本研究RIP結果顯示Min6細胞中Meg3可以綁定Ezh2。

在小鼠的胚胎干細胞中，Meg3可以綁定PRC2亞基Ezh2，進而調控下游靶基因。有研究表明，成年胰島β細胞的功能維持與轉錄抑制因子有關。已報道的轉錄抑制因子有Hes1、Bhlhe22、Insm1、Sox6、Crem、Stx3[8]。在小鼠胚胎時期，Hes1負性調控胰腺內分泌細胞的形成，抑制Ngn3蛋白的表達[9]。在小鼠MIN6細胞系中，Hes1被抑制后，轉錄因子MafA、Pdx1、NeuroD等轉錄因子的核酸水平上調[10]。作為通過染色質修飾調控靶基因的轉錄抑制子PRC2由Ezh2、Suz12、Ezh1、Eed等多種亞基組成[11-12]。眾多的lncRNA通過綁定PRC2復合物，結合到靶基因的H3組蛋白第27位賴氨酸處，發揮組蛋白甲基轉移酶的功能，使其甲基化，從而使靶基因表達沉默，在表觀遺傳學上對其進行調控[13]。而最近研究發現，在小鼠的胚胎干細胞中，Meg3可以綁定PRC2亞基Ezh2，進而調控下游靶基因。因此，本文致力于找到一個中間因子，可以介導Meg3與轉錄因子之間的關系，Meg3表達下調之后，作用于中間因子，使其表達上調，從而引起轉錄因子表達下調。

作者的前期研究發現，在Balb/c小鼠中，Meg3在胰島β細胞中特異性高表達，用siRNA干擾Meg3，胰島素的合成和分泌明顯減少，胰島素相關轉錄因子MafA、Pdx1、NeuroD的核酸和蛋白水平表達下調，提示Meg3通過促進胰島素的合成和分泌來維持胰島細胞的功能[14]。本文發現在Min6 細胞中，Meg3可以綁定Ezh2，Ezh2能直接綁定在Hes1的啟動子區域并介導H3K27me3的修飾過程。

綜上所述，Meg3綁定PRC2沉默Hes1基因的表達是通過H3K27me3修飾，進而導致該基因的轉錄失活。在小鼠β細胞中，Meg3可以募集PRC2復合物的亞基Ezh2并綁定Ezh2，抑制下游轉錄抑制因子Hes1的表達。

參考文獻：

[1]Chris Wallace,Deborah J Smyth,Maisuria-Armer M,et al.The imprinted DLK1-MEG3 gene region on chromosome 14q32.2 alters susceptibility to type 1 diabetes[J].Nat Genet,2010,42(1):68-71.

[2]Karapetyan AR,Buiting C,Kuiper RA,et al.Regulatory Roles for Long ncRNA and mRNA[J].Cancer,2013,5(2):462-490.

[3]Margueron R,Reinberg D.The polycomb complex PRC2 and its mark in life[J].Nature,2011,469(7330):343-349.

[4]Ferrari KJ,Scelfo A,Jammula S,et al.Polycomb-dependent H3-K27me1 and H3K27me2 regulate active transcription and enhancer fidelity[J].Mol cell,2014,53(1):49-62.

[5]Kaneko S,Son J,Shen SS,et al.PRC2 binds active promoters and contacts nascent RNAs in embryonic stem cells[J].Nat Struct Mol Biol,2013,20(11):1258-1264.

[6]Kaneko S,Bonasio R,Saldana-Meyer R,et al.Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin[J].Mol Cell,2014,53(2):290-300.

[7]Kaur P,Rong TJ,Karolina DS,et al.A long non-coding RNA, BC048612 and a microRNA,miR-203 coordinate the gene expression of neuronal growth regulator 1 (NEGR1) adhesion protein[J].Biochim Biophys Acta,2015,151(3): 939-947.

[8]Kornfeld JW,Brüning JC.Regulation of metabolism by long, non-coding RNAs[J].Front Genet,2014,5(2):54-57.

[9]Qu X,Afelik S,Jensen JN,et al.Notch-mediated post-translational control of Ngn3 protein stability regulates pancreatic patterning and cell fate commitment[J].Dev Biol,2013,376(1):1-12.

[10] Ball AJ, Abrahamsson AE,Tyrberg B,et al.HES6 reverses nuclear reprogramming of insulin-producing cells following cell fusion[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,355(2):331-337.

[11] Tonne JM,Sakuma T,Deeds MC,et al.Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy[J].Dis Model Mech,2013,6(5):1236-1345.

[12] Tennant BR,Robertson AG,Kramer M,et al.Identification and analysis of murine pancreatic islet enhancers[J].Diabetologia,2013,56(3): 542-552.

[13] Zhang EB,Kong R,Yin DD,et al.Long noncoding RNA ANRIL indicates a poor prognosis of gastric cancer and promotes tumor growth by epigenetically silencing of miR-99a/miR-449a[J].Oncotarget,2014,5(8):2276-2292.

[14] 胡艷妹,尤梁惠,朱亞男,等.沉默長鏈非編碼 RNA Meg3 損傷小鼠胰島細胞的胰島素分泌功能[J].中國生物化學與分子生物學報,2016,32(3):289-294.

作者單位：1.銅陵職業技術學院醫學系，安徽銅陵 244000

LncRNA Meg3 Silences Hes1 Expression by Binding to PRC2 in Mice Pancreatic β Cells(Min6)

HU Yan-mei, Zhu Ya-nan, De-wei

(1.Medical Department of Tongling Polytechnic,Tongling 244000,China; 2.Department of Biochemistry and Molecular Biology School of Basic Medical Science,Nanjin Medical University,Nanjing 210029,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the relationship of Meg3 and PRC2 complexes as well as its downstream genes in pancreatic β cells (Min6). MethodsqPCR detection Meg3 in localization of Min6 cell nucleus and cytoplasm, we also verified that the relationship of Meg3, Ezh2 as well as its downstream genes Hes1 by RIP, UCSC Genome Browser and CHIP. ResultsThe expression of Hes1 was significantly suppressed by downregulation of Si-Ezh2 and Si-Suz12 using small interfering RNA in Min6 cells. The results of CHIP assays showed that Ezh2 could directly bind to the promoter region of Hes1 and mediate H3K27me3 modification, while transfection of Meg3 and Ezh2 led to reduced Ezh2 and H3K27 binding ability. ConclusionThese results indicated that lncRNA Meg3 could bind PRC2 complex in Min6 cells, and Ezh2 could regulate the expression of downstream transcription factor gene Hes1 directly. The discovery would further enrich and improve the gene regulatory network of pancreatic β cells on Meg3 and PRC2 complexes.

Key words:lncRNA；pancreatic β cells；Meg3； PRC2；Hes1 expression

文章編號：1672-688X(2016)02-0081-04

DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.02.001

中圖分類號：R587.1;Q786

文獻標志碼：A

基金項目：安徽省2015年度高校自然科學研究基金重點項目(No.KJ2015A374)
安徽省2015年度高等教育振興計劃重大項目(No.2015zdjy175)

收稿日期：2016-03-03

作者簡介：胡艷妹(1979-)，女，安徽蚌埠人，講師，從事胰腺發育研究工作。