Robo 1蛋白在胃癌中的表達及臨床意義

張春煜 孟杰 徐大鵬 張亮

Robo 1蛋白在胃癌中的表達及臨床意義

張春煜 孟杰 徐大鵬 張亮

目的 研究跨膜蛋白Robo 1在胃癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系。方法 免疫組化P-V法檢測54例胃癌和20例癌旁組織中Robo 1蛋白的表達情況及Robo 1蛋白在不同病理特征下的表達；用CD 34標記微血管，計算微血管密度（microvessel density，MVD）探討胃癌組織中Robo 1與MVD的關系。結果 Robo 1蛋白在胃癌中的陽性表達率為70.37%，在癌旁組織中的陽性表達率為10.00%，兩者比較，差異有統計學意義（χ2=21.48，P＜0.05）。Robo 1蛋白的表達水平與淋巴結轉移、TNM分期相關，與腫瘤的大小、分化程度無關。Robo 1蛋白在胃癌組織中MVD為（24.74±2.59），與癌旁組織（18.10±1.71）相比顯著增高，差異有統計學意義（t=10.629，P＜0.05）。結論 胃癌中Robo 1蛋白表達增高，且與腫瘤的臨床病理特征有關，提示Robo 1蛋白在胃癌的形成過程中扮演著重要角色，胃癌中微血管密度增高可以推測出微血管的形成促進了腫瘤的生長與侵襲。

胃癌；Robo 1蛋白；微血管密度（microvessel density，MVD）；免疫組組織化學

Robo 1蛋白是跨膜蛋白Roundabout家族中的一員，另外還有Robo 2、Robo 3、Robo 4，在神經系統中表達的是Robo 1、2、3，參與神經細胞的遷移和調控神經軸突延伸。而Robo 4在血管內皮細胞表面表達，抑制內皮細胞的遷移。此外，Robo家族在非神經系統中也發揮著重要的作用，尤其在一些腫瘤中表達異常，Robo 1啟動子甲基化和轉錄子沉默等表觀遺傳學的改變，導致了Robo 1表達減少或缺失，提示腫瘤的發生發展與Robo 1失活有關，Robo 1是抑癌基因；也有學者的研究證實Slit 2/ Robo 1可以通過β-catenin/TCF、PI 3K/Akt信號通路及

CXCL 12/CXCR 4、MMPs等信號轉導分子促進腫瘤的發生發展。本實驗通過檢測Robo 1蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達及微血管形成情況，探討Robo 1蛋白在胃癌形成中的可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取2014年1月～2015年9月間遼河油田總醫院病理科胃癌切除術標本54例，其中男32例，女22例，年齡39～78歲，平均年齡（45.05±3.73）歲。同時收集20例癌旁組織（距癌變部位邊界5 cm以外且經病理證實無癌變的胃粘膜組織），所有患者術前均未接受化療及放療。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色 標本經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片厚度4 μm。兔抗人多克隆抗體Robo 1（濃度

1︰50，購自Abcam公司），鼠抗人CD 34抗體由北京中衫公司提供，操作步驟按照P-V 9000試劑盒說明書進行。對照：以PBS代替一抗作為陰性對照；已知陽性片（胃癌）作為陽性對照。

1.2.2 免疫組化結果判讀 Robo 1陽性染色為胞漿著色，以陽性細胞數百分率和染色強度得分之和進行評分。高倍鏡下隨機選取5個視野。（1）按細胞染色深淺評分：0分，細胞不顯色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。（2）按陽性細胞比例評分：1分，陽性細胞數占細胞總數<25%；2分，陽性細胞數占細胞總數25%～50%；3分，陽性細胞數占細胞總數51%～75%；4分，陽性細胞數占細胞總數>75%。兩值相加≥3分為陽性，＜3分為陰性。

CD 34判斷標準為：管腔小于8個紅細胞大小的微血管或由內皮細胞形成的條索、腔隙狀，染色為棕黃色。首先低倍鏡（×10）下找到腫瘤組織血管最密集區域，高倍鏡（×40）下計數3個不重復視野內的微血管數，取其平均值作為最終微血管密度。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0統計分析軟件，計數資料以百分數和例數表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Robo 1蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達及MVD計數Robo 1蛋白在胃癌組織中的陽性表達率為70.37%，明顯高于癌旁組織（10.00%），兩者比較，差異有統計學意義（χ2=21.48，P＜0.05）。胃癌組織中微血管排列紊亂，大小不一，其MVD為（24.74±2.59）；癌旁組織的MVD為（18.10±1.71），兩者比較，差異亦有統計學意義（t=10.629，P＜0.05）。見表1。

2.2 胃癌組織中Robo 1蛋白與MVD計數的關系 38例

Robo 1蛋白陽性表達者，其MVD為（23.16±2.11），陰性表達16例，其MVD計數為（17.94±1.18），兩者比較差異有統計學意義（t=9.26,P＜0.05）。

表1 Robo 1蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達及MVD計數結果

2.3 胃癌組織中Robo 1蛋白與臨床病理特征的關系Robo 1蛋白與淋巴結轉移、TNM分期相關，與腫瘤的大小及分化程度無關。見表2。

表2 Robo 1蛋白與胃癌臨床病理特征的關系

3 討論

許多研究已經證實，Robo 1蛋白在不同的腫瘤中發揮著抑癌基因或促進腫瘤進展的作用[1]。Robo 1蛋白在口腔癌、直腸癌、惡性黑色素瘤等多種腫瘤組織中高表達，促進腫瘤的發生發展，發揮著癌基因的作用[2-5]。在肺癌和乳腺癌中Robo 1蛋白通過交接趨化因子受體4及其配體下游靶向分子的磷酸化，抑制腫瘤的生長[6-7]。本實驗中Robo 1蛋白在胃癌組織中的陽性表達為70.37%，高于癌旁組織，且與腫瘤的TNM分期、淋巴結轉移相關，而與腫瘤的分化程度、腫瘤大小無關，推測Robo 1蛋白在胃癌的發生發展中發揮著至關重要的作用。

當實體腫瘤體積小于2 mm3時，腫瘤細胞通過彌散獲取營養，大于2 mm3時則必須有新生血管的形成，為腫瘤細胞繼續增殖和轉移提供氧氣和養料。腫瘤血管的形成是由宿主細胞和腫瘤細胞分泌的腫瘤血管生成因子（TAF）引起的，同時減少血管新生抑制物（TIMPs）的表達。新生血管管壁薄弱，只有一層內皮細胞，無平滑肌、神經末梢及相應的淋巴管道，腫瘤血管內皮細胞的細胞器增多，呈現高度擴張的狀態；而且新生血管內皮細胞的基底膜不完整，腫瘤細胞易穿透，為腫瘤的增殖及侵襲轉移做好準備。腫瘤微血管密度（MVD）是反映腫瘤新生血管的一個重要指標，是評估腫瘤增殖及侵襲的一個重要條件[8]。本實驗中胃癌組織中的MVD為（24.74±2.59），高于癌旁組織，進一步證實了微血管形成及增生對腫瘤的生長及侵襲的重要影響。

已有的研究發現，Robo 1作為Slit 2的受體，與Slit 2結合后能夠使血管內皮細胞發生遷移，進而促進腫瘤微血管的生成，作為血管形成中的重要通路之一，Slit/Robo這一信號通路具有相對獨立性，受血管受體類型及其他信號分子的調控[9-12]。Wang等[13-14]發現腫瘤細胞能夠分泌Slit 2，用特異性抗體R 5阻斷Slit 2/Robo 1信號通路后,腫瘤血管密度明顯降低、腫瘤體積顯著縮小。

腫瘤的信號轉導異常是腫瘤的發生發展的一個重要因素,雖然研究者己經發現了若干分子在信號傳導中發揮著不可替代的作用，但各種分子之間的相互調節機制尚不清楚。本實驗中顯示高表達的Robo 1蛋白能夠促進腫瘤細胞的生長及新生血管的形成，為腫瘤的輔助診斷和抗血管治療提供了重要的線索。

[1] Ma S，Liu X,Geng JG,et al.Increased SLIT immunoreactivity as a biomarker for recurrence in endometrial carcinoma[J].Am J Obstet Gynecol,2010,202(1)：68 e 61-68 ell.

[2] 王靜,王樂,劉芳芳,等.Robo 1蛋白在乳腺癌中的表達及其與乳腺癌腦轉移的關系[J].中華腫瘤雜志,2011,33（6）：447-451.

[3] 鄭丹,劉彬彬,劉銀坤,等.人肝癌細胞系Slit/Robo啟動子甲基化狀態及基因表達的研究[J].中華肝臟病雜志，2009，17（3）：198-202.

[4] Wang B,Xiao Y,Ding BB,et al.Induction of tumor angiogenesis by Slit-Robo signaling and inhibition of cancer growth by blocking Robo activity[J].Cancer cell，2003，4：19-29.

[5] 馬宇光,王麗京,韓冰,等.Slit-Robo信號對口腔癌Tb細胞凋亡作用的影響[J].中華口腔醫學雜志，2006，41（4）：232-235.

[6] Dallol A,Da Silva NF,Viacava P,et al.SLIT 2,a human homologue of the Drosophila Slit 2 gene,has tumor suppressor activity and is frequently inactivated in lung and breast cancers[J].Cancer research，2002，62：5874-5880.

[7] Marlow R,Strickland P,Lee JS,et al.SLITs suppress tumor growth in vivo by silencing Sdf 1/Cxcr 4 within breast epithelium[J].Cancer research，2008，68：7819-7827.

[8] 席銀雪,宋鑫,陳惠新,等.微血管密度在胃癌癌變多階段組織中的表達及其意義[J].中華醫學雜志,2006,86(48)：3405-3408.

[9] Wong K,Ren XR,Huang YZ,et al.Signal transduction in neuronal migration：roles of GTPase activating proteins and the small GTPase Cdc 42 in the Slit-Robo pathway[J].Cell,2001,107(2)：209-221.

[10] Aijaz P,Hifzur RS,Jacquelyn KK,et al.ROBO 1,a tumor suppressor and critical molecular barrier for localized tumor cells to acquire invasive phenotype：Study in African-American and Caucasian prostate cancer models[J].Int J Cancer,2014,135(11)：2493-2506.

[11] Haley EB,Marie CR,Timothy AE,et al.Slit Binding via the Ig 1 Domain Is Essential for Midline Repulsion by Drosophila Robo1 but Dispensable for Receptor Expression,Localization,and Regulation in Vivo[J]. G 3(Bethesda),2015,5(11)：2429-2439.

[12] Wu JY,Feng LL,Park HT,et al.The Neuronal repellent Slit inhibits leukocyte chemotaxis induced by chemotactic factors[J]. Nature,2001,410(6831)：948-952.

[13] Wang B,Xiao Y,Ding BB,et al.Induction of tumor angiogenesis by Slit-Robo signaling and inhibition of cancer growth by blocking Robo activity[J].Cancer Cell,2003,4(1)：19-29.

[14] Wang LJ,Zhao Y,Han B,et al.Targeting Slit-Roundabout signaling inhibits tumor angiogenesis in chemical-induced squamous cell carcinogenesis[J].Cancer Sci,2008,99(3)：510-517.

Objective To study the Robo 1 transmembrane protein expression in gastric carcinoma tissue and its relationship with clinical pathological features.Methods Immunohistochemical method to detect P-V 54 cases of gastric carcinoma and 20 cases Robo 1 protein expression in tissue adjacent to carcinoma,and compare the different pathological characteristics under Robo 1 protein expression;With CD 34 markers capillaries,microvascular density (microvessel density,MVD),and to discuss the relationship between gastric cancer tissues Robo 1 and MVD. Results The positive expression rate of Robo 1 protein in gastric carcinoma was 70.37%,the positive expression rate was 10.00% in the tissue adjacent to carcinoma,both comparison,difference was statistically significant (χ2= 21.48,P < 0.05).Robo 1 protein expression level and lymph node metastasis and TNM stages related,has nothing to do with the degree of differentiation and tumor size.Robo 1 protein positive MVD in gastric cancer tissue was (24.74 ± 2.59),significantly higher compared with tissue adjacent to carcinoma (18.10 ± 1.71）,with statistical significance (t = 10.629,P < 0.05).Conclusion Higher Robo 1 protein expression in gastric cancer,and is associated with the clinical pathological features of the tumor,prompt Robo 1 protein plays an important role in the formation process of gastric cancer,cancer of the stomach in the microvascular density increased can infer the formation of the microvascular promoted the growth and inasieness of tumor.

Gastric carcinoma; Robo 1 protein; Microvessel density (MVD); Immunohistochemical

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.17.002

遼寧 124010 遼河油田總醫院 （張春煜 孟杰 張亮） 盤錦骨科醫院 （徐大鵬）

張亮 E-mail：huizi 320@163.com